L'étape clé dans le fonctionnement d'une expérience d'analyse de protéine réussie prépare un lysat cellulaire de haute qualité. Western blots sont quelques-unes des expériences les plus communes de protéines d'analyse effectuées dans les laboratoires de recherche biologique, et la préparation de lysat cellulaire est la première étape. L'analyse des protéines et la protéomique permettent aux scientifiques de se renseigner sur les fonctions des protéines à travers les systèmes biologiques.
Instructions
1 Porter des gants avant de manipuler un des matériaux ou de l'équipement.
2 Préparer le tampon de lyse en combinant les ingrédients énumérés dans "Choses que vous devez." Ajuster le pH du tampon à 6,8 au moyen d'acide chlorhydrique.
3 Refroidir le tampon de lyse. Si le tampon de lyse est préparé un jour ou plus à l'avance, se détendre dans le réfrigérateur. Sinon, le refroidir pendant 1 heure sur la glace.
4 Ajouter 1,5 ml de la culture de cellules en suspension dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
5 Spin le tube à 3200 rotations par minute (RPM) pendant 2 minutes dans la centrifugeuse. Filage provoque les cellules pour former un culot au fond du tube. Le milieu de culture cellulaire doit être translucide à la fin du cycle de la centrifugeuse.
6 Jeter le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot au fond du tube.
7 Remettre en suspension le culot dans 150 ul de tampon de lyse refroidi. Ce qui contribue à solubiliser le culot de cellules et commence le processus de rupture des membranes cellulaires.
8 Ajouter des perles de verre pour augmenter le volume total dans le tube de 0,3 ml. Les billes provoquent l'agrégation supplémentaire du culot cellulaire lorsque tourbillonnement.
9 Vortex du tube sur le vortex à pleine vitesse pendant 1 minute.
dix Refroidir le tube pendant 30 secondes sur la glace. Évitez d'exposer le tube pour réchauffer des températures pendant de longues durées, car cela peut conduire à la dégradation des protéines.
11 Vortex le tube à nouveau à pleine vitesse pendant 1 minute.
12 Centrifuger le tube à 2400 RPM pour retirer les constituants du lysat de cellules en un culot au fond du tube.
13 Les lysats cellulaires de magasin dans le congélateur.