Les protéines sont de grosses molécules constituées de chaînes d'acides aminés qui se replient dans des structures tridimensionnelles. Les protéines ou des complexes de protéines exécutent beaucoup de tâches les plus importantes dans la cellule, allant de catalyser des réactions à des fonctions structurelles. Les biologistes ont souvent besoin d'isoler une protéine spécifique pour une étude plus approfondie ou pour d'autres applications; ils utilisent une variété de techniques pour ce faire.
SDS-PAGE Electrophorèse sur gel
Dans cette technique, les protéines sont d'abord traitées avec un détergent appelé le dodécylsulfate de sodium ou le SDS, les dénaturer et leur faire perdre leur structure. Les molécules de détergent négativement chargés forment des complexes avec les protéines. Souvent, un produit chimique appelé mercaptoethanol est ajouté à briser les liaisons disulfure entre des résidus cystéine dans la protéine ainsi. Ensuite, le mélange de protéines est ajouté à des puits dans une plaque de gel de polyacrylamide et un champ électrique, les amène à migrer en direction de l'anode chargée positivement. protéines plus petites vont migrer plus rapidement tandis que les protéines plus grandes vont migrer plus lentement, de sorte que les protéines peuvent être séparées sur la base de leur taille ou de la masse moléculaire.
Sédimentation Velocity & Equilibrium
Une centrifugeuse est essentiellement un rotor à deux bras avec un tube à chaque extrémité. Un moteur fait tourner le rotor à des vitesses très élevées, on soumet le contenu de chaque tube à une force de plusieurs fois plus forte que la force de gravité. Les protéines présentes dans la solution migrer progressivement vers le fond du tube; certains d'entre eux, cependant, va le faire plus rapidement que d'autres. travaux d'équilibre de sédimentation repose sur un principe similaire, mais ajoute une torsion: l'échantillon est dispersé dans un gradient de densité formé par une concentration élevée de saccharose ou de chlorure de césium. Que la centrifugeuse tourne, les protéines dans l'échantillon migrent progressivement vers l'endroit où la densité de flottaison est la même que celle de son environnement.
colonne de chromatographie
La Chromatographie sur colonne est une technique puissante qui consiste à forcer un mélange à travers une colonne garnie d'une matrice poreuse de billes ou de petites particules. écoulement du solvant à partir du sommet de la colonne pousse le mélange à travers la matrice, mais des protéines ou des composés du mélange d'interagir avec la matrice plus que ne le font les autres et donc prennent plus de temps à se manifester. Grâce à ce processus, la Chromatographie sur colonne permet de séparer un mélange en ses composants. Il y a un certain nombre de variantes différentes sur cette même idée de base. chromatographie échangeuse d'ions, par exemple, utilise une matrice composée de perles qui sont soit chargés positivement ou négativement, de sorte que les protéines de charge opposée sont retenus dans la colonne. la chromatographie d'affinité utilise des billes ou des particules enrobées avec une molécule qui se lie à une protéine spécifique dans le mélange - un anticorps, par exemple, ou le substrat d'une enzyme (la molécule de l'enzyme agit sur). La protéine d'intérêt reste dans la colonne alors que les autres traversent et peuvent être enlevés ultérieurement en modifiant le pH ou en ajoutant une solution concentrée de sel.
isoélectrofocalisation
Isoélectrofocalisation implique également une électrophorèse sur gel, mais les protéines ne sont pas prétraité pour les dénaturer. Au lieu de cela, ils sont ajoutés à une plaque de gel de polyacrylamide, où les tampons spéciaux ont été utilisés pour créer un gradient de pH. Selon leur structure, les protéines différentes ont des points isoélectriques ou des valeurs de pH à laquelle ils ont aucune charge nette. Une fois qu'un champ électrique est appliqué, chaque protéine va migrer jusqu'à ce qu'il atteigne son point isoélectrique.