Western Blot ou immunotransfert des protéines, est une procédure qui permet de détecter la présence de protéines spécifiques dans un échantillon. Le transfert des protéines sur une membrane après électrophorèse permet la détection de protéines cibles; Les enzymes se fixent les anticorps liés à la protéine individuelle et produire une couleur lorsqu'il est exposé à un substrat spécifique. Décapage une membrane Western blot élimine physiquement les protéines résiduelles et des anticorps.
Instructions
1 Placer 10 ml de Tween 20, 15 grammes de glycine et 1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans un flacon en verre de 1 litre. Ajuster le pH à 2,2 au moyen d'acide chlorhydrique, en mesurant au moyen d'un pH-mètre. Ajouter de l'eau ultrapure suffisante pour porter le volume total à 1 litre. Utilisez ce premier tampon.
2 Placez la membrane utilisée dans le plat en verre. Ajouter une quantité suffisante du tampon produite dans l'étape précédente pour recouvrir la membrane. Après 10 minutes, jeter le tampon utilisé et ajouter du tampon frais. Encore une fois, attendez 10 minutes et jeter le tampon utilisé.
3 Verser tampon PBS assez dans le plat de verre pour couvrir la membrane. Attendre 10 minutes et jeter le tampon. Verser le tampon PBS frais dans le plat en verre et attendre encore 10 minutes. Jeter le tampon utilisé.
4 Verser tampon TBST assez dans le plat de verre pour couvrir la membrane. Attendez cinq minutes et jeter le tampon utilisé. Verser tampon TBST frais dans le plat en verre. Encore une fois, attendez cinq minutes, et jeter le tampon utilisé.
5 Testez l'efficacité de la procédure de décapage en exposant la membrane à des anticorps qui se fixeront à des protéines résiduelles, comme l'exige la procédure spécifique de Western blot vous suivez. Exposer les anticorps à une solution d'indicateur. S'il n'y a pas de réaction (indiquée par une absence de changement de couleur), la membrane est prête pour être réutilisée.
Conseils et avertissements
- Incuber la membrane à la température ambiante pendant toute la procédure.
- Manipuler la membrane avec des pinces stériles pour éviter toute contamination.
- Les produits chimiques utilisés dans cette procédure peuvent causer des blessures. Porter un manteau de laboratoire, des lunettes et des gants tout au long de la procédure.
- Exécuter la procédure dans un environnement stérile, tel qu'une hotte à flux laminaire, afin d'éviter la contamination de la membrane.