Comment utiliser Restore Western blot Stripping Buffer 21059

July 19

Comment utiliser Restore Western blot Stripping Buffer 21059


Transfert de Western est une technique de biotechnologie pour la détection d'une protéine spécifique dans un échantillon. Elle implique la séparation des protéines par la taille et la charge, au moyen d'une procédure appelée électrophorèse sur gel; de les transférer à une membrane de PVDF ou de nitrocellulose; et l'addition d'anticorps primaires. Si la protéine d'intérêt est présent, les anticorps se lient à elle.

Enfin, le chercheur ajoute des anticorps secondaires qui se lient aux anticorps primaires. Les anticorps secondarty portent une enzyme qui émet de la lumière en présence de la protéine; la quantité de lumière qu'ils émettent reflète la quantité de protéine dans l'échantillon.

Restore est une marque de blot tampon stripping que vous pouvez utiliser pour supprimer les anticorps primaires et secondaires si vous avez besoin de re-sonder l'échantillon.

Instructions

1 Réchauffez la bouteille de restauration Western Blot Stripping Buffer 21059 jusqu'à ce qu'il soit à la température ambiante. En sortant de la bouteille pendant plusieurs heures ou toute la nuit, va l'amener à la température ambiante. Si nécessaire, vous pouvez le vérifier avec un thermomètre.

2 Laver la tache avec un tampon de lavage pour éliminer tout substrat chimioluminescent qui reste de la première sonde. Ajouter suffisamment de restauration Western Blot Stripping Buffer complètement mouiller le blot. Le fabricant recommande 20 millilitres comme une quantité appropriée pour un transfert de 8 par 10 centimètres.

3 Incuber la tache avec le tampon à la température ambiante. Si les anticorps que vous avez utilisé pour sonder le blot étaient une affinité élevée, vous devrez peut incuber la tache à la température légèrement plus élevée de 37 degrés Celsius (98,6 degrés Fahrenheit) et laisser plus de temps. En général, cependant, 5 à 15 minutes devraient être suffisantes pour éliminer à la fois primaire et secondaire des anticorps.

4 Ajouter le substrat de peroxydase de raifort chimioluminescente à la tache, et placer une feuille de film photographique sur la membrane. Le film change de couleur chaque fois que la lumière frappe. Si le film photographique n'a détecté aucune lumière émise par l'échantillon après 5 minutes, vous avez supprimé l'anticorps secondaire et son enzyme conjugué.

5 Ajouter l'anticorps secondaire à la tache. Laver la tache dans un tampon de lavage et de l'exposer à nouveau pour un film photographique, tout comme à l'étape 4.

Si vous ne voyez pas un changement après 5 minutes, vous avez supprimé l'anticorps primaire et peut re-sonder le blot pour valider vos résultats précédents.

Si vous n'avez pas supprimé avec succès soit l'anticorps primaire ou secondaire, re-incuber le blot dans Supprimer Western Blot Stripping Buffer, comme décrit dans les étapes 2 et 3. Laissez encore 5 à 15 minutes pour assurer l'élimination des deux anticorps primaires et secondaires , puis répétez les étapes 4 et 5.

Conseils et avertissements

  • Il est important de laisser incuber la tache assez longtemps pour enlever tout l'anticorps primaire et secondaire, mais pas assez longtemps pour endommager la protéine d'intérêt. En général, 5 à 15 minutes devraient suffire; en fonction de la protéine que vous travaillez avec, cependant, il peut y avoir des exceptions.
  • Ne jamais effectuer une expérience de ce type sans porter un équipement approprié de sécurité (par exemple, des lunettes de protection chimique, des gants, une blouse de laboratoire) et en suivant les protocoles et les procédures de sécurité de votre laboratoire.