Des expériences in vitro sont celles réalisées en dehors d'un organisme vivant dans un tube à essai ou un environnement similaire. Les scientifiques peuvent faire des copies d'ARN ou des transcriptions d'un gène in vitro par un processus appelé transcription in vitro. L'enzyme qui permet la transcription d'ARN basé sur le gène est appelé une ARN polymérase. Une telle molécule est la polymérase SP6. Elle exige un fragment d'ADN appelé le promoteur SP6 afin de fonctionner correctement.
Promoteurs
Un promoteur est la région de l'ADN lié par une ARN polymerase pour initier la transcription. La polymerase SP6 nécessite qu'une séquence très particulière soit présent dans le promoteur afin de lier, de sorte que lorsque la polymerase SP6 est utilisée pour la transcription in vitro, le gène doit contenir le promoteur SP6 pour la transcription de se produire. La polymerase SP6 est d'un type de virus appelé un bactériophage; sociétés de biotechnologie produisent cette polymérase en infectant les bactéries salmonella avec le phage et l'isolement de la suite de la polymérase.
Expression
l'expression ou l'activité basale se réfère au degré d'expression en l'absence d'autres molécules qui augmentent ou diminuent le niveau de la transcription. Activateurs ou répresseurs, par exemple, sont des protéines qui peuvent se lier au promoteur ou à d'autres régions régulatrices de gènes et, soit d'aider à recruter l'ARN polymérase ou pour l'empêcher de se lier. Les inducteurs sont des molécules qui stimulent la production du produit génique en augmentant les niveaux d'expression.
SP6
L'activité basale du promoteur SP6 variera en fonction des conditions de test. Le facteur le plus important, bien sûr, est de savoir comment vos conditions expérimentales peuvent affecter l'activité et comment SP6 compare à d'autres systèmes. En général, la polymerase SP6 et les promoteurs offrent une efficacité inférieure à la T7 ou T3 in vitro systèmes de transcription, bien que dans des conditions idéales SP6 est à peu près comparable à ces deux autres. Comme SP6, T7 et T3, les deux utilisent une ARN polymérase de bactériophage.
Conditions
La concentration en sel et la température sont deux facteurs importants pour déterminer l'activité de base. SP6 est très sensible à la concentration en sel, de sorte que des concentrations en sel plus élevées peuvent diminuer fortement son activité. Toutes choses égales par ailleurs, l'expression est significativement supérieure à 104 degrés Fahrenheit qu'à 99 degrés Fahrenheit. concentration Nucleotide est une autre considération importante. De faibles concentrations peuvent potentiellement causer la transcription de mettre fin prématurément et ainsi diminuer votre efficacité. L'augmentation de la concentration de nucléotides permet d'éviter ce problème. Si vous synthétiser des sondes d'ARN, cependant, en ajoutant trop de nucléotide non marqué va diminuer la quantité de nucléotide marqué dans le produit final.