Comment séparer l'ADN des globules blancs

January 15

Comment séparer l'ADN des globules blancs


l'acide désoxyribonucléique, ou ADN, se trouve dans chaque partie d'un organisme vivant. Elle touche tous les aspects de la façon dont vous développez, de la couleur de vos cheveux à votre nature émotionnelle. L'ADN se trouve dans le noyau d'une cellule; puisque les globules rouges matures ont pas de noyau, l'ADN doit être prélevé soit des globules blancs (leucocytes), ou de globules rouges immatures et nucléées. les méthodes d'extraction d'ADN sont universels indépendamment de la source de la matière - raclures de joues, des biopsies de tissus, ou les cheveux, par exemple - mais certains processus particuliers sont nécessaires lorsque l'on travaille avec du sang, en raison de sa nature délicate. Le protocole suivant nécessite une formation préalable aux techniques de laboratoire de base, la compréhension des précautions et des lois relatives à la manipulation des produits biologiques infectieux.

Instructions

1 Isoler les leucocytes. Transférer le sang dans un tube de centrifugation à fond en V, tel qu'un 15 millilitres tube Falcon. Centrifuger l'échantillon pendant 10 minutes à 300 g et 1200 tours par minute pour sédimenter les cellules du plasma. Jeter ou congeler le plasma si cela est nécessaire. La couche mince entre les globules rouges et le plasma sédimentées est la couche leucocytaire, qui contient des globules blancs, à partir de laquelle l'ADN est extrait. Très aspirer soigneusement cette couche et transférer dans un nouveau tube.

2 Effectuer la lyse des cellules pour libérer l'ADN. Resuspendre la couche leucocytaire dans 10 à 20 ml de solution de lyse préchauffé et faire tourner doucement à 55 degrés centigrades pendant 2 à 3 heures.

3 Nettoyer. Extraire le lysat résultant 3 à 4 fois par remise en suspension dans du phénol / chloroforme sous une hotte à flux laminaire chimique, en suivant les instructions fournies pour le phénol / chloroforme (peut varier selon les fabricants). Chaque fois, recueillir seulement la phase supérieure et jeter la phase inférieure. Suivre ce soit avec un éther ou une étape d'extraction au chloroforme. La préparation finale doit être vide de toute hémoglobine.

4 Précipité. L'éthanol, l'ADN extrait de la solution, puis remettre en suspension le culot dans un volume approprié de TE (ce qui est généralement évaluée par oeil en fonction de la taille de la pastille et peut varier de quelques microlitres à un millilitre plein). Ajouter 20 microgrammes par ml de RNaseA pendant une heure pour inactiver des ARNases.

5 Purifier. Répéter l'extraction au phénol / chloroforme et précipitation à l'éthanol étapes trois fois et remise en suspension dans un volume final pouvant aller jusqu'à 500 microlitres de tampon TE. Lire la pureté de cette préparation sur un spectrophotomètre. Idéalement, un aborbance à 260/280 de 1,6-1,8 est souhaitée; sinon répéter l'étape 5.

Conseils et avertissements

  • La couche leucocytaire se trouve très légèrement au-dessus des globules rouges culottées et doit être aspiré très lentement et doucement afin de ne pas perturber la fraction des globules rouges du sang.
  • Placer immédiatement l'ADN sur la glace une fois qu'il a été extrait pour empêcher dégradants.
  • Manipulation du sang est considéré comme une procédure hautement infectieuse. Ne pas procéder sans autorisation préalable de la police locale ou les autorités réglementaires. Toujours maintenir un environnement stérile et gérer tous chimique en utilisant un équipement de protection individuelle.