Le réactif de Sanger est utilisé pour aider à déterminer la séquence d'acides aminés qui constituent un peptide. Le réactif se verrouille sur - ou une étiquette - l'acide aminé à la fin d'une chaîne peptidique, également connu sous l'extrémité N-terminale. Le peptide peut ensuite être cassé en morceaux (hydrolysées) et les acides aminés individuels examinés à l'aide de diverses méthodes de chromatographie. Quelle que soit l'acide aminé porte l'étiquette est celle à la fin. Le réactif de Sanger est également connu sous le dinitrofluorobenzène (DNFB). Une fois qu'il a accroché à un acide aminé, il est désigné sous le nom de DNP-composé.
Instructions
1 Peser 3 milligrammes de peptide sur une échelle. Le placer dans un tube de centrifugation. Ajouter environ 0,3 ml d'eau, 0,3 ml de réactif de Sanger et 0,075 ml de bicarbonate de sodium.
2 Laisser le tube de centrifugation à incuber à la température ambiante pendant une heure. Pendant l'incubation, secouer doucement le tube pour empêcher le mélange de se séparer. Vérifier le pH de la solution toutes les 15 minutes avec du papier pH. Le pH doit être maintenu au-dessus 9. Si elle commence à baisser, ajouter une petite quantité de bicarbonate de sodium (environ une goutte à la pipette Pasteur).
3 Après l'incubation, ajouter 1,5 ml d'eau et une quantité égale d'éther. Laisser la solution se séparer en couches. Vous pourriez avoir à centrifuger le mélange pour le séparer. Retirer la couche d'éther (la partie supérieure, la couche jaune) avec une pipette et le jeter.
4 Ajuster le pH à 1,0 en ajoutant lentement de l'acide chlorhydrique. Ajouter un peu d'acide à la fois, remuer doucement, puis vérifier le pH avec du papier pH. Au total, il devrait exiger environ 0,15 ml d'acide. Si le pH descend en dessous de 1,0, ajouter une petite quantité (pas plus d'une chute) de bicarbonate de sodium.
5 Ajouter 3 ml d'éther. Laisser le mélange se séparer. Maintenant, la couche supérieure (la, la couche d'éther jaune) contient votre DNP-composé. En utilisant une pipette, extraire soigneusement cette couche et le transférer dans un tube à essai propre. Placer le tube d'essai de côté et laisser le liquide s'évaporer, laissant derrière lui un sèche, solide jaune.
6 Lavez votre solide avec de l'acétone. Ajouter 0,3 millilitres d'acétone, mélanger délicatement et extraire le liquide avec une pipette. Ajouter 0,75 millilitres d'acide dans le tube d'essai. Le peptide est marqué et maintenant prêt à être hydrolysée et analysée par la méthode de chromatographie de votre choix.