Un antigène est une molécule reconnue et liée par un anticorps. Si vous essayez de préparer l'antigène pour une expérience, selon la façon dont vous avez produit l'antigène et sur votre protocole, il existe plusieurs types de techniques chromatographiques que vous pourriez utiliser. Chromatographie immunoaffinité est le plus puissant d'entre eux, mais aussi le plus cher. Chromatographie d'exclusion, la chromatographie et chromatographie échangeuse d'ions nickel-histidine sont des possibilités, aussi bien.
immunoaffinité Chromatographie
Cette technique utilise des billes d'agarose traitées pour fixer des anticorps à eux; les anticorps sont spécifiques pour l'antigène d'intérêt. Une fois que les perles ont été préparées, vous versez la suspension contenant les billes dans la colonne et versez tampon par l'intermédiaire de laver tout conservateur ou les sels restants; Cette étape est appelée l'équilibrage de la colonne. Enfin, vous allez ajouter l'échantillon contenant l'antigène. Seul l'antigène se lie aux anticorps; les autres composants du mélange vont circuler à travers la colonne et de sortir l'autre extrémité, ou éluer, comme vous ajoutez plus de tampon. Cette approche est très puissant mais aussi très cher, parce que les anticorps sont coûteux à produire.
Une Chromatographie nickel-Histidine
Si vous produisez un antigène en transformant e. coli avec le gène codant pour la protéine, on peut marquer la protéine avec un marqueur 6-histidine pour la purification plus facile. Cette "étiquette" est juste une série de six acides aminés consécutifs cloué sur une extrémité de la protéine. L'ensemble de ces histidines ont une très forte affinité pour les ions métalliques tels que le nickel et le cobalt, de sorte que l'antigène peut être purifié en utilisant des billes qui ont acide nitriloacétique attachés. La NTA lie les ions nickel et les étiquettes 6-histidine à son tour lier le nickel. Préparation de la colonne est similaire à une Chromatographie d'immunoaffinité.
Taille-chromatographie d'exclusion
SEC utilise des colonnes beaucoup plus longues que les procédures de Chromatographie d'affinité, et ces colonnes doit être préparé à l'avance, car les billes ont besoin de temps pour régler. Les perles dans une expérience SEC sont en fait des perles de Sephadex qui ont des trous en eux, un peu comme de minuscules éponges. Les petites protéines peuvent faire leur chemin dans ces trous alors que de grandes protéines ne peuvent pas, alors quand l'échantillon est versé dans la colonne, les plus grandes protéines éluent avant que les petits. Vous pouvez suivre les progrès des protéines à travers la colonne en utilisant des colorants de suivi, qui se comportent d'une manière similaire.
Ion Exchange Chromatography
Comme le pH d'une solution devient, certains acides aminés plus basiques sur une protéine devenir déprotoné ou perdre des ions d'hydrogène, de sorte que leur charge nette devient moins positive (ou plus négatif). À un certain pH spécifique, la protéine aura pas de charge nette; en d'autres termes, il sera neutre, ni positivement ni négativement chargé. Ce pH est appelé le point isoélectrique, et il varie pour des protéines différentes. chromatographie par échange d'ions tire parti de ces différences pour aider à purifier l'antigène. L'échantillon est introduit dans une colonne avec un tampon à un pH spécifique, et les billes de la colonne contient des sites qui interagissent avec des ions chargés positivement (ou parfois des sites qui interagissent avec des ions chargés négativement à la place). Les protéines et les antigènes avec des frais plus élevés seront plus longs à se frayer un chemin à travers la colonne, ce qui permet de les séparer.