Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une méthode d'analyse chimique instrumentale. Il est utilisé pour trouver la composition chimique des inconnues. L'échantillon, dissous dans un solvant (phase mobile), est pompée à travers un tube ou une colonne, garnie d'une matière solide poreuse. L'affinité relative des produits chimiques dans l'échantillon vers le garnissage de la colonne permettra de déterminer combien de temps il faut les produits chimiques pour passer à travers la colonne. Ceci est connu comme étant le temps de rétention d'une substance chimique donnée. Les temps de rétention sont trouvés expérimentalement par l'exécution d'un composé chimique connu à travers la colonne en cours de test.
Instructions
Détermination du temps de rétention
1 Décider sur les conditions que vous allez utiliser pour trouver le temps de rétention de la colonne en cours d'évaluation. Les conditions de base comprennent le type de solvant de phase mobile, la vitesse d'écoulement du solvant, le type de détecteur et le réglage et le produit chimique spécifique qui sera utilisé. Ces conditions peuvent parfois être trouvées dans une méthode officielle existante de test.
2 Connecter la colonne HPLC à une pompe de phase mobile, à l'entrée de la colonne et le détecteur, à la sortie de la colonne.
3 Activer les différentes composantes de la HPLC: l'ordinateur pompe, le détecteur et l'acquisition de données.
4 Remplir le réservoir de phase mobile avec un solvant approprié et démarrer l'écoulement de la phase mobile à travers la colonne par l'intermédiaire de la pompe.
5 Préparer ou obtenir une solution standard du produit chimique utilisé pour le test. Souvent, ces normes d'étalonnage peuvent être achetés ready-made. Vous pouvez également faire une solution standard en dissolvant une quantité appropriée du produit chimique dans un solvant de phase mobile. Sauf si vous suivez une méthode spécifique qui vous dit différemment, commencer avec une concentration standard d'environ 50 parties par million. Cela peut être augmentée ou diminuée de façon à atteindre un pic de sortie de détecteur qui est à la fois suffisamment grand pour l'intégration et suffisamment faible pour maintenir une forme de pic symétrique.
6 Injecter une quantité appropriée de la solution étalon sur la CLHP. Un volume d'environ 10 microlitres, est typique. Dans le même temps, commencer l'acquisition de données par l'ordinateur.
7 Suivre la sortie du détecteur à la sortie de l'ordinateur d'acquisition de données. Quand un pic apparaît sur la sortie, attendre deux minutes, puis arrêter l'acquisition de données.
8 En utilisant un logiciel d'acquisition de données, intégrer la sortie du détecteur pour identifier le pic chimique. A partir du logiciel, lire le temps de rétention au cours de laquelle le sommet du pic est trouvé.
Conseils et avertissements
- Les temps de rétention pour un produit chimique et de la colonne donnée peut changer en raison de facteurs tels que la température ambiante, débit de phase mobile et le vieillissement de la colonne. Les temps de rétention doivent être revérifiées à intervalles réguliers.
- Puisque le logiciel HPLC détermine normalement le temps de rétention du point de la sortie de pic de détecteur pour un produit chimique le plus élevé, les changements de forme de pointe (par exemple, en raison de la colonne surcharge) peut donner des changements apparents dans le temps de rétention.