L'expression des protéines est un processus dans lequel des informations codées dans les gènes se traduit en une protéine. Dans leurs hôtes, de nombreuses protéines sont produites dans des quantités trop faibles pour l'étude dans le laboratoire. Par conséquent, les scientifiques utilisent diverses techniques pour surexprimer des protéines afin de produire une quantité suffisante pour la purification et la caractérisation. Les gènes d'intérêt sont insérés dans des vecteurs d'expression (généralement à partir du système d'expression pET), qui sont des molécules d'ADN qui peuvent se répliquer indépendamment de l'ADN chromosomique. Ces vecteurs sont ensuite introduits dans une cellule bactérienne, habituellement une souche d 'Escherichia coli, la croissance et la surexpression. Si vous êtes chanceux, votre protéine se surexpriment après une croissance de nuit simple dans un milieu de croissance, cependant, ce processus nécessite souvent dépannage afin d'obtenir des niveaux d'expression optimaux.
Instructions
Optimisation du temps et de la température de croissance
1 Préparer deux ou plus de cinq millilitres (ml) des cultures de votre protéine en ajoutant une colonie bactérienne à partir d'une plaque de gélose contenant votre protéine dans un échantillon de 5 ml de milieu LB. Cultiver les cultures pendant une nuit sous agitation à 37 degrés Celsius.
2 Ajouter 500 microlitres de chaque culture d'une nuit à une culture distincte contenant 50 ml de LB le lendemain matin et les placer dans un shaker à 37 Celsius.
3 Permettre aux cultures de croître jusqu'à ce que l'absorbance à 600 nm atteigne 0,6 (phase exponentielle de croissance). Mesurer l'absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre obturée avec LB médias. Une fois que la densité optique atteigne 0,6, laisser les cultures se développer pendant des moments différents. points de temps suggérés sont 3 heures, 6 heures, 12 heures, 18 heures et 24 heures.
4 Vérifiez l'absorbance après chaque point de temps et d'économiser des échantillons de densité cellulaire égale pour chaque culture dans un tube de 1,5 ml Eppendorf. A titre de référence, une absorbance de 1 à 600 nm correspond typiquement à une densité cellulaire d'environ 10 ^ 9 cellules / ml. Ajuster la quantité de chaque échantillon que vous enregistrez en fonction de l'absorbance.
5 Répétez les étapes ci-dessus, mais au lieu d'essayer différents points de temps, essayez la température différente en plaçant 50 ml de cultures en shakers de différentes températures une fois l'absorbance atteint 0,6. Les températures suggérées sont 37 ° Celsius, 30 ° Celsius, 21 ° Celsius ou 18 ° Celsius. Laisser croître pendant un moment de votre choix. Répétez la collecte d'échantillons comme décrit à l'étape 4.
L'utilisation d'inducteurs
6 Préparer les cultures comme décrit au paragraphe 1, les étapes 1 et 2.
7 Ajouter de l'IPTG à une concentration finale de 1 mM à une culture une fois que l'absorbance à 600 nm atteigne 0,6. Le système d'expression pET est contrôlée par le promoteur lac, qui est le site où l'ARN polymerase se lie afin de commencer la transcription du gène. IPTG déplace le répresseur lac, une protéine de liaison à l'ADN qui se lie à proximité du promoteur et empêche l'attachement de l'ARN polymerase. Le déplacement du répresseur permet la liaison de l'ARN polymerase et la transcription du gène.
8 Ajouter 5 pour cent de saccharose à une culture après l'absorbance a atteint 0,6. Le saccharose est une source de carbone pour la croissance bactérienne.
9 Ajouter à la fois IPTG et le saccharose à une troisième culture. Vous allez maintenant avoir au moins 4 cultures: un avec rien ajouté pour un contrôle, un avec IPTG ajouté, l'un avec du saccharose ajouté, et une fois avec IPTG et saccharose ajouté.
dix Permettre aux cultures de croître pendant un certain temps et à une température de votre choix et recueillir des échantillons comme décrit dans la section 1, étape 4.
L'analyse des niveaux d'expression
11 Centrifugeuse tous les échantillons recueillis à la vitesse maximale dans une centrifugeuse de table. Jeter le liquide, laissant culot au fond du tube.
12 Resuspendre culots bactériens dans un pour cent OTG, un détergent qui décompose les cellules.
13 Exécuter une analyse sur gel SDS-PAGE sur tous les échantillons collectés et surveiller les niveaux de l'expression de protéine dans chaque échantillon. La condition de croissance qui produit l'expression la plus protéine est ce que vous devez utiliser pour la croissance à grande échelle, la purification et la caractérisation de votre protéine.
En outre Optimisation
14 Variez les types de médias si l'expression est encore difficile. choix alternatifs comprennent de Super Broth et Terrific Broth.
15 Variez les souches de cellules bactériennes si l'expression est encore difficile. souches communes de E. coli utilisées pour l'expression sont nommées BL21 (DE3) et JM109 et sont connues pour surexprimer des protéines bien.
16 Tester différentes combinaisons de temps de croissance, la température et l'induction si nécessaire. Ceux-ci peuvent également être testés dans des milieux de croissance différents et des souches bactériennes.
Conseils et avertissements
- Il peut être nécessaire de diluer chaque échantillon avant de prendre l'absorbance si les valeurs sont trop élevées pour votre spectrophotomètre pour mesurer avec précision. Une dilution de dix fois est recommandé en prenant 100 microlitres de votre culture et en ajoutant 900 microlitres de milieu LB. Assurez-vous de tenir compte du facteur de dilution lors de l'enregistrement des échantillons.
- Toujours porter un équipement de protection individuelle lorsque vous travaillez dans un laboratoire. Cela comprend une blouse de laboratoire, des lunettes et des gants.