Comment fonctionne Molecular Cloning Work?

July 27

Comment fonctionne Molecular Cloning Work?

Introduction au clonage

Le clonage moléculaire est le processus de faire des copies d'un morceau de l'information génétique pour une analyse ultérieure. Ce processus est effectué en transférant un fragment d'ADN provenant d'un organisme dans une molécule capable de reproduire des copies de l'ADN transféré. La molécule la plus souvent utilisée pour faire des copies de l'ADN dans le clonage moléculaire est une substance appelée un plasmide bactérien. Les plasmides sont des formes indépendantes de la vie qui ne doivent pas être dans les bactéries hôtes pour générer des copies d'ADN. techniques de clonage moléculaire sont fréquemment utilisés dans le laboratoire et ont été en usage depuis leur découverte dans les années 1970.

Isolement de l'ADN et le transfert

Avant l'ADN étudié peut être inséré dans un plasmide il doit d'abord être isolé, sous forme séparée du reste de l'ADN et brisé en fragments. La première étape de ce procédé, l'isolation de la section d'ADN qui sera reproduite, est effectuée en utilisant une variété de techniques, dont la plus commune est appelée réaction en chaîne par polymérase, ou PCR. La méthode PCR non seulement isole un fragment d'ADN, il augmente aussi la quantité d'ADN disponible. Cette partie amplifiée de l'ADN est ensuite inséré dans un plasmide (ou un autre vecteur similaire) et traité avec des enzymes spécialisées qui prépare l'ADN pour la réplication. Ces enzymes décomposent l'ADN en fragments linéaires et le traitement de ces fragments dans les brins d'ADN qui contiennent uniquement l'ADN d'intérêt. Le plasmide traité est maintenant prêt pour le transfert.

transfection

Le plasmide préparé est ensuite transféré dans une cellule de bactérie hôte par un processus appelé transfection. Transfection est le plus souvent réalisé en utilisant un processus appelé électroporation, bien qu'il y ait un certain nombre de techniques qui peuvent accomplir la transfection. Électroporation agit en augmentant la perméabilité des cellules hôtes en utilisant un champ électrique pour créer des pores dans la paroi cellulaire. Les bactéries contenant le plasmide traitées sont ensuite transférées sur une plaque de croissance des colonies où les cellules sont cultivées.

Identification et confirmation du succès

Les processus impliqués dans la création d'un clone moléculaire ne sont pas du tout efficace. Avant le transfert vers la plaque de croissance des bactéries sont marquées d'une façon de sorte que les bactéries contenant l'ADN souhaité peut être identifié visuellement avec un marqueur de couleur ou de telle sorte que seules les bactéries avec l'ADN souhaité sont capables de croître. Les colonies qui se développent sont ensuite testés pour assurer que l'ADN souhaité est présent. Une fois la séquence d'ADN est confirmée les bactéries peuvent alors être utilisées pour des études d'investigation.