La réaction en chaîne par polymerase, ou PCR, est une façon de faire de grandes quantités d'une séquence particulière d'ADN en utilisant seulement une petite quantité de la substance d'origine. Cette technique, le raffinement de ce qui a valu Kary Mullis 1993 Prix Nobel de chimie, comprend trois étapes distinctes.
Composants de la réaction
PCR est un procédé d'amplification. Afin de générer beaucoup de microgrammes d'un acide nucléique donné, vous devez, bien entendu, l'ADN d'intérêt, appelé un modèle. Il peut provenir de toute source - animaux, plantes, des virus ou des bactéries. (ARN peut être analysé par PCR, mais vous devez d'abord utiliser l'enzyme virale transcriptase inverse pour générer une copie d'ADN de l'ARN;. Puis, vous pouvez utiliser cette copie d'ADN comme matrice) Pour la PCR, vous devez avoir un chauffage sous forme de résistance de l'ADN polymérase de l'enzyme, généralement la polymerase Taq, ce qui rend les nouveaux brins d'ADN. Vous devez également amorces; de courtes sections d'ADN qui se lient à des endroits précis sur le gabarit et touchent la réplication de cette partie du modèle. Enfin, vous devez dNTP, les nucléotides utilisés pour construire les nouveaux brins, et une solution spécifique saline, appelé un tampon, dans lequel pour effectuer la PCR. Ceci contribue à stabiliser les réactifs et les produits de la réaction.
En dénaturant l'ADN
La première étape de PCR est dénaturant la matrice d'ADN, ce qui signifie décompressant les deux brins qui, liés entre eux, forment la structure en double hélice de l'ADN. Dans le cas de la PCR, le modèle est brièvement chauffé entre 92 ° à 95 ° C, assez chaud pour rompre les liaisons hydrogène qui maintiennent l'ADN sous sa forme en double hélice caractéristique et le séparer en deux simples brins.
Annelage des amorces à des brins d'ADN
Après dénaturation est terminée, le mélange est refroidi à une température aussi basse que 45 ° C. Ceci permet des liaisons hydrogène pour former entre complémentaires paires de bases de nucléotides de la matrice d'ADN et les amorces d'ADN, avec l'adénine se lier à la thymine et la cytosine à guanine. La température de recuit est déterminée en se basant sur ce qui est connu au sujet de la matrice d'ADN et la séquence d'amorce. Par exemple, si l'amplification d'un gène d'un moustique, si vous avez des amorces d'une espèce de moustique dans le même genre, vous pouvez avoir une température de recuit plus élevée; si la seule séquence disponible est d'une mouche des fruits, la température de recuit devra être plus faible parce que les séquences correspondront moins parfaitement. Recuit se produit rapidement et efficacement, car il y a beaucoup plus d'amorce d'ADN que l'ADN matrice dans le mélange, surtout au début.
L'extension des amorces ADN
Une fois que le recuit a eu lieu, une forme de l'ADN polymérase stable à la chaleur dans les étapes pour commencer rapidement, l'addition séquentielle des nucléotides aux brins d'amorces - 50 à 100 nucléotides par seconde. Pour lancer ce à la vitesse, le mélange est chauffé de nouveau, cette fois à un plus modeste 72 ° C
PCR est un processus exponentiel. Cela signifie que, après un cycle, soit deux fois la quantité originale d'ADN matrice, existe; après deux cycles, soit quatre fois le montant initial existe; Après trois cycles, huit fois, et ainsi de suite.