Dans des réactions chimiques catalysées par une enzyme, l'enzyme diminue la quantité d'énergie d'activation requise par la liaison temporaire avec le substrat et en le tournant dans un état tendu. K (catalyseur) ou "kcat" pour que la réaction se réfère à la constante indépendante de la concentration pour la vitesse à laquelle une enzyme particulière peut métaboliser un substrat en une molécule de produit. Pour calculer kcat, les scientifiques ont mélangent plusieurs tubes à essai avec des concentrations variables de substrat (connu comme un "essai enzymatique") et les tester à des intervalles de temps constants avec un spectrophotomètre lumière pour mesurer les concentrations croissantes de molécules de produit. Ces données sont ensuite tracées sur un graphique et analysé.
Instructions
Calcul de vitesses initiales
1 Tracer un graphique de la concentration du produit en fonction du temps pour les données du premier tube d'essai de l'essai enzymatique. Remarque: l'axe horizontal doit être «le temps», et l'axe vertical devrait être "la concentration du produit."
2 Calculer la droite de régression linéaire pour les points de données que vous avez tracé dans la section 1, étape 1. Bien que Excel et calculatrices graphiques peuvent facilement déterminer ce modèle linéaire, vous pouvez obtenir une estimation de la pente de la droite de régression en divisant la différence de concentration du produit entre les données adjacentes des points par leur différence dans le temps.
3 Notez la pente de la droite de régression linéaire de la section 1, étape 2 comme "la vitesse de réaction initiale (Vo)." Remarque: dans le modèle de la ligne de régression »[concentration du produit] = m [temps] + b," le coefficient "m" est la pente.
4 Répéter les étapes 1, 2 et 3 pour le reste des tubes à essai dans l'essai.
calcul Vmax
5 Graphiquement l'inverse de la concentration du substrat pour chaque tube à essai, par rapport à l'inverse de sa vitesse initiale de la réaction (à partir de la section 1, étape 4). Par exemple, si la vitesse initiale pour un tube à essai avec une concentration initiale en substrat de 50 micromoles (uM) était de 80 pM / s, les inverses seraient 1/50 pM pour la concentration du substrat et 1/80 iM / s pour la première rapidité. Remarque: la concentration du substrat inverse doit être sur l'axe horizontal, et la vitesse initiale inverse doit être sur l'axe vertical.
Remarque: la concentration du substrat doit être sur l'axe horizontal, et la vitesse de réaction initiale devrait être sur l'axe vertical.
6 Déterminer la ligne de régression linéaire pour le tableau que vous avez tracé dans la section 2, l'étape 1. Remarque: parce que vous aurez besoin de connaître l'y-intersection de la ligne de régression, vous devez saisir les points de la section 2, étape 1 dans Excel ou un calculatrice graphique et utiliser la fonctionnalité de modélisation de régression intégrée.
7 Diviser 1 par l'ordonnée à l'intersection entre la ligne de régression linéaire. Cela vous donnera la valeur de l'inverse de Vmax, la vitesse maximale de réaction pour l'enzyme. Remarque: si le modèle de régression linéaire prend la forme "[Inverse Vo] = m [. Inverse Substrat Conc] + b," alors la valeur de "b" serait le y-intersection. Diviser 1 par "b" pour calculer l'inverse de Vmax.
8 Diviser 1 par le résultat de la section 2, étape 3 pour calculer la valeur réelle de Vmax.
9 Déterminer la concentration de l'enzyme dans le dosage d'origine (voir les données brutes). Remarque: la concentration de l'enzyme est identique pour tous les tubes d'essai; Seules les concentrations de substrat varient dans le dosage.
dix Diviser la Vmax (à partir de la section 2, étape 4) par la concentration de l'enzyme (à partir de la section 2, étape 5). Le résultat est la valeur de Kcat.