Comment puis-je éviter PCR Primer Dimer?

September 24

Comment puis-je éviter PCR Primer Dimer?


Une réaction en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée pour créer des millions de copies d'une séquence d'acide désoxyribonucléique (ADN). Cette technique est utilisée en médecine légale pour reproduire de petites quantités d'ADN trouvées dans des échantillons biologiques à des scènes de crime afin d'avoir des quantités suffisantes pour analyser des éléments de preuve. Il est également largement utilisé en biologie moléculaire et la recherche en biotechnologie pour produire de grandes quantités d'un échantillon pour des expériences. Pour démarrer le processus de réplication, vous avez besoin de courtes séquences d'ADN appelés amorces qui se fixent à la séquence d'ADN plus à répliquer. Parfois, les amorces se fixent les uns aux autres plutôt qu'à la séquence d'ADN cible, en formant des dimères qui inhibent le processus de réplication.

Instructions

1 Concevoir les amorces de sorte qu'ils ne sont pas auto-complémentaire à eux-mêmes ou entre eux, en particulier à l'extrémité 3 '. Cela signifie éviter des séquences de nucléotides dans votre conception primaire qui ont tendance à hybrider avec d'autres séquences dans l'amorce.

2 Gardez la cytosine (G + C) des concentrations guanine et dans votre amorce entre 40 pour cent et 60 pour cent. G et C ont une plus grande propension à hybrider les uns avec les autres et d'augmenter ainsi les chances de dimérisation.

3 Utilisez un "démarrage à chaud" enzyme polymerase pour votre PCR. Une enzyme de démarrage à chaud est active uniquement lorsque la température de votre réaction a été à 95 degrés Celsius pendant 10 à 12 minutes, contrairement à une polymérase normale qui est actif à des températures plus basses. Le démarrage à chaud permet à la séquence d'ADN cible pour dénaturer complètement avant que l'enzyme devient active, ce qui minimise la formation de dimères d'amorces qui peuvent se produire à des températures plus basses avec une polymerase normale.

4 Effectuer séries de tests pour votre PCR où vous varier les concentrations de vos amorces pour trouver la plus faible concentration à laquelle votre réaction sera couronnée de succès. Les faibles concentrations d'amorces réduisent les chances d'obtenir des dimères d'amorces.