Sonication est une méthode utilisée ubiquitaire de cisaillement des cellules ouvertes dans moléculaire, cellulaire, de la microbiologie et d'autres laboratoires. Sonication est utile car elle ne modifie pas la composition chimique des cellules ou le tampon de cellules, et ne modifie pas la charge des cellules comme les méthodes d'électroporation font. Il est un processus assez simple qui doit être ajusté en fonction des types d'expériences et de cellules de celui utilisé, et il y a seulement quelques conseils clés à suivre.
Le processus
Tout d'abord, préparer l'échantillon de cellules dans sa mémoire tampon ou support approprié, et refroidir cet échantillon dans un bécher de glace (ou de l'eau glacée pour le refroidissement plus rapide). Laver la buse de la machine à ultrasons avec de l'eau et essuyez avec un Kimwipe.
Mettre la machine de Disruptor sonication / cellulaire sur, et régler la puissance de sortie à une puissance appropriée, selon le type de cellule et expérience. Insérez la buse du sonicateur dans votre tube d'échantillon de cellules et tourner sur la machine; permettent sonication de se produire pendant cinq à 30 secondes à la fois. (Permettre sonication pendant plus de 30 secondes de façon drastique réchauffe l'échantillon et peut souvent provoquer la dénaturation.) Bien que sonication, déplacez doucement le tube d'échantillon autour de la buse pour permettre l'accès des buses pour les différentes zones du volume. Il est généralement préférable de ne pas laisser la pointe de la buse pour atteindre près de la surface du volume, car cela peut causer barbotage / moussage de votre échantillon.
Après la première sonication, mélanger votre échantillon en retournant plusieurs fois, puis de sonication à nouveau pour une quantité égale de temps, tout en gardant l'échantillon sur la glace.
Optimisation est importante
Il est généralement préférable d'optimiser votre protocole de sonication pour chaque lignée cellulaire différente utilisée, comme il faut trouver un équilibre idéal entre suffisamment de cellules cisaillées et la dénaturation minimale / dommageables de l'échantillon. Cela peut être fait par sonication pour différentes durées et les paramètres de puissance de sortie, puis de vérifier les cellules sous un microscope pour le fractionnement.
Par exemple, on peut commencer par faire trois salves de cinq secondes à 50 pour cent de puissance, puis le temps et augmenter la puissance si seulement une petite partie de la population cellulaire apparaît fractionne sous le microscope.
Exemple spécifique
Par exemple, les cellules de E. coli utilisées pour la croissance et la purification d'une protéine de surface de liaison au récepteur (fragment C-terminal de Clostridium perfringens enterotoxin ou «C-CPE») peut être traité par ultrasons dans un volume de 7 à 10 ml pour les deux 30 -Deuxième rafales à puissance de sortie maximale. Le tampon de la suspension cellulaire est 1 x PBS avec 0,2 mg / ml de lysozyme.
Le dispositif de sonication utilisé pour cela est une cellule Disruptor Microson ultrasons.