Transfert de Western est une technique de laboratoire pour la détection de l'abondance des protéines d'intérêt. Il est un procédé précis le plus souvent utilisé pour comparer les niveaux de protéines de deux échantillons, l'un traité d'une certaine manière et à une non traitée et utilisée comme témoin. La détection des protéines est basée sur leur liaison à des anticorps spécifiques et est efficace pour assurer la détection de seulement votre protéine d'intérêt donc.
Instructions
Protocole Western Blot
1 Des échantillons de protéines séparées par le poids moléculaire en utilisant une électrophorèse sur gel. Sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl (SDS-PAGE) est le plus souvent utilisé.
2 Faire tremper les papiers blot et des membranes de nitrocellulose dans le méthanol, puis passer à transférer tampon.
3 Transfert des protéines du gel vers une membrane de nitrocellulose par l'assemblage d'un sandwich d'une feuille de transfert, une membrane de nitrocellulose, le gel, et d'un autre papier de transfert dans la cellule de transfert et de transformer la cellule de transfert sur la tension suggérée. Les protéines sont transférées du gel sur la membrane dans le même schéma de séparation.
4 Jeter les papiers blot et gel. Incuber la membrane avec 5 pour cent de lait pour lier les zones collantes sur la nitrocellulose qui pourrait interférer avec la détection de votre protéine. Laisser incuber pendant au moins une heure. Le lait est généralement dissous dans 1X Tris-solution saline tamponnée Tween-20 (TBST), mais peut varier en fonction de votre protocole.
5 Verser le lait et incuber la membrane pendant une nuit à 4 degrés Celsius avec un anticorps primaire choisi de se lier à votre protéine d'intérêt. Consultez la fiche d'information du produit pour quelle solution pour dissoudre votre anticorps (habituellement le lait) et dans quelle concentration.
6 Lavez votre membrane avec un tampon de lavage au moins 5 fois pendant 5 minutes à chaque fois. Ceci garantira que tout anticorps primaire non lié est éliminé par lavage de la membrane afin de ne pas interférer avec les lectures. 1X TBST est un tampon de lavage couramment utilisé.
7 Incuber votre membrane une heure à température ambiante avec un anticorps secondaire qui reconnaîtra votre anticorps primaire. Les anticorps secondaires sont identifiés par quelles espèces ils interagissent avec, comme anti-souris ou anti-lapin. Choisissez l'anticorps secondaire qui correspond à l'espèce source de votre anticorps primaire. Veiller à l'anticorps secondaire est conjugué à une enzyme peroxydase de raifort et de vérifier avec le fabricant pour les conditions et les concentrations de dissolution.
8 Laver la membrane avec le tampon de lavage de la même manière que ci-dessus pour assurer l'enlèvement de tout anticorps secondaire non lié. Cela permet d'éviter des niveaux de bruit de fond.
9 Incuber votre membrane avec une chimioluminescence amplifiée (ECL) réactif pendant 5 minutes à température ambiante. des kits d'ECL sont munis de deux composants, un composant de luminol et un composant de peroxydase. Ces deux sont mélangés ensemble avant l'addition à votre membrane. La peroxydase de raifort sur votre anticorps secondaire lié sera cliver le luminol de la ECL provoquant la membrane pour émettre de la lumière où l'anticorps secondaire est lié.
dix Sceller votre membrane dans une couverture de feuille de plastique et de bande dans une cassette de film pour le développement.
11 Exposez votre membrane à un film dans une pièce sombre et passer à travers le développeur de visualiser le signal de votre protéine. Il est important d'obtenir suffisamment de bandes sombres pour voir la protéine, mais pas si sombre qu'ils sont indiscernables. Variez les temps d'exposition pour obtenir un signal clair.
12 Calculer l'abondance relative de vos échantillons de protéines en utilisant un programme pour mesurer densitométrie ou l'obscurité de chaque bande.
Dépannage Western Blot
13 Survolez votre blot-membrane-gel-blot sandwich avec une pipette en verre avant de commencer le transfert. Cela permettra d'éliminer les bulles d'air qui interfèrent avec le transfert de protéines adéquat.
14 Varier la concentration de votre anticorps primaire si vous obtenez un signal faible qui ne peut être détectée après des temps d'exposition longs. Une concentration plus élevée d'anticorps primaire favorisera plus la liaison à votre protéine.
15 Variez la concentration de votre anticorps secondaire s'il y a un niveau élevé de bruit de fond sur votre blot. Une concentration d'anticorps secondaire peut aider à réduire la liaison non spécifique.
16 Lavez votre membrane plus longtemps pour aider à l'élimination du bruit de fond.
17 Bloc avec le lait pendant plus de 1 heure si les films développés contiennent beaucoup de bruit de fond. En outre, le sérum normal de l'anticorps secondaire, l'animal hôte peut être utilisé pour le blocage.
Conseils et avertissements
- Toujours lire les étiquettes de tous les réactifs utilisés et d'utiliser et de les éliminer selon les spécifications. Toujours porter un équipement de protection individuelle tels que gants, une blouse de laboratoire, et des lunettes lorsque vous travaillez dans le laboratoire.