Western blot est une technique utilisée en biochimie pour détecter les types de protéines dans un échantillon. Les protéines sont séparées par électrophorèse sur gel et transférés sur une membrane, où il est sondé avec des anticorps. Les anticorps se fixent aux protéines sur la membrane. Une substance fluorescente est ensuite ajouté à la membrane, qui réagit avec les anticorps tels que les protéines sont visibles après l'exposition au film.

Instructions

1 Lavez vos mains et de mettre sur latex ou en nitrile.

2 Retirer le tissu cellulaire de la chambre d'incubation. Placer environ 1 gramme de tissu dans un mortier. Ajouter suffisamment d'azote liquide au mortier pour couvrir le tissu. Broyer le tissu congelé avec le pilon jusqu'à ce qu'il soit une poudre.

3 Ajouter la poudre dans un tube à essai. Ajouter 10 ml de tampon de lyse dans le tube d'essai. Utilisez un polytron en 20 secondes rafales jusqu'à ce que la poudre et le liquide sont homogènes.

4 Boucher le tube à essai et le placer dans une centrifugeuse. Exécutez la centrifugeuse à une force centrifuge de 500 à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Éliminer le liquide dans la partie supérieure du tube avec une pipette et le jeter.

5 Ajouter 5 ml de tampon de lyse au culot dans le tube à essai pendant 20 secondes. Centrifuger le tube pour le même temps et à la même température et de la force que dans l'étape 4. Retirer le liquide à la partie supérieure du tube d'essai. Ajouter 5 millilitres plus tampon de lyse et répéter l'étape de centrifugation.

6 Ajouter un tampon de remise en suspension suffisante pour le tube à essai pour couvrir la pastille. Agiter le tube à essai doucement pour mélanger le culot et le tampon. Verser le liquide dans des tubes Eppendorf et congeler les échantillons à une valeur négative de 80 degrés Celsius.

Conseils et avertissements

• Évitez cycles répétés de gel-dégel de vos échantillons, car il peut endommager les protéines.

Western blots sont une technique d'électrophorèse sur gel d'analyser la teneur en protéines d'un échantillon biologique. Cette technique est une procédure standard dans les laboratoires de recherche biologique et peut également être utilisé en médecine légale ou de diagnostic biomédical.

Western blots ont la protéine purifiée à partir d'un échantillon de tissu et la soumettre à un processus appelé SDS-PAGE, lorsque les protéines sont séparées en poids, en utilisant un courant électrique. Une fois que les protéines sont séparées, elles peuvent être transférées à un difluorure de polyvinyle (PVDF) et analysées pour différentes protéines d'intérêt.

Instructions

Développer un Gel Western blot pour une protéine d'intérêt

1 Laver soigneusement la membrane de PVDF en solution TBST. Placer la membrane dans un récipient rectangulaire remplie avec du TBST et la placer sur un agitateur basculant ou à la rotation à basse vitesse (80 à 90 Hz) pendant 10 minutes. Dump de la TBST dehors et répéter ce lavage.

2 Laver la membrane dans un tampon de blocage. Versez délicatement la solution de TBST out et verser une quantité équivalente de tampon de blocage dans le récipient. Placer le récipient sur un agitateur à faible vitesse pendant une heure.

3 Mélangez votre anticorps primaire en attendant que le tampon de blocage pour terminer. Vérifiez votre anticorps pour voir ce que la dilution est recommandé par le fabricant et diluer en conséquence. Par exemple, si votre anticorps doit être mélangé dans une dilution de 1: 5000, vous pouvez mesurer 10 ml de tampon de blocage et ajouter 2 pi (microlitres) de l'anticorps primaire.

4 Verser le tampon de blocage et ajouter la solution d'anticorps primaire au récipient. La quantité de temps nécessaire pour incuber l'anticorps primaire avec la membrane de PVDF variera avec l'échantillon d'anticorps et les tissus. La procédure la plus courante consiste à placer la membrane sur un agitateur à vitesse lente à 4 degrés C (dans un réfrigérateur) pour 16 à 18 heures. Votre anticorps devrait venir avec un temps d'incubation recommandé.

5 Rincer la membrane de PVDF. Verser l'anticorps primaire et à rincer la membrane pendant 10 minutes dans du TBST à température ambiante. Répéter cette étape de lavage, deux ou trois fois.

6 Incuber la membrane dans un anticorps secondaire. Votre anticorps secondaire est livré avec une dilution recommandée. Par exemple, si la dilution recommandée est de 1: 10.000, vous pouvez ajouter 1 pi à 10 ml de tampon de blocage. Assurez-vous que votre anticorps secondaire est marqué "HRP-conjugué" parce que d'autres anticorps peuvent ne pas fonctionner correctement avec des kits ECL.

7 Développer la membrane de PVDF en utilisant un système ECL ou de chimioluminescence comparables. Vérifiez les instructions qui viennent avec votre kit ECL pour voir comment mélanger la solution de développement et comment développer correctement la membrane.

Développer le PVDF Membrane

8 Exposer un film à la membrane. Dans les 10-15 minutes de ECL développer, mettre la membrane de PVDF à une chambre noire. Dans l'obscurité totale, exposer un film vierge à la membrane et le placer dans la machine de développement de la chambre noire.

9 Une fois que le film sort du développeur, allumer les lumières et voir si le film est suffisamment développé. Si le film est trop léger, vous aurez besoin d'exposer un nouveau film pour une période plus longue. Si le film est trop sombre, vous pouvez essayer d'exposer un autre film pendant une minute ou 30 secondes.

dix Notez le temps d'exposition qui a créé un film bien développé. Vous pouvez utiliser ce temps pour tous les essais ultérieurs de cette procédure.

11 Numériser le film développé dans un ordinateur en utilisant votre scanner. Avec la plupart des scanners, vous pouvez placer le film sur la vitre du scanner et appuyer sur un bouton. Consultez la documentation qui accompagne votre scanner pour déterminer si cela est la procédure appropriée. Une fois que le film est balayé dans, enregistrer l'image avec un nom de fichier descriptif que vous serez en mesure de reconnaître plus tard.

12 Ouvrez l'image enregistrée dans le programme ImageJ. ImageJ est développé par le National Institutes of Health (NIH) et est disponible gratuitement en ligne.

Comparez les bandes dans les films développés

13 Obtenir une mesure de fond. Faites une sélection rectangulaire autour de la plus grande bande dans le Western blot en utilisant l'outil de sélection (la première icône dans la barre d'outils). Déplacez ensuite le rectangle, une zone peu développée vide du film. Maintenez la touche Ctrl + M pour mesurer l'obscurité de fond.

14 Déplacez le rectangle à la première bande sur le film et appuyez à nouveau sur Control-M. Répétez cette en séquence pour toutes les bandes sur le film que vous souhaitez analyser.

15 Copiez les données de la bande. Lorsque vous commencez à mesurer, une fenêtre "Résultats" apparaîtra. Une fois que vous avez terminé la mesure, mettre en évidence toutes les données de mesure et appuyez sur Ctrl-C pour le copier. Ouvrez votre programme de feuille de calcul et appuyez sur Ctrl-V pour coller les données de mesure. étiqueter soigneusement toutes les données collées et enregistrez le fichier de données lorsque vous avez terminé la mesure de tous les films.

16 Déterminer la densité de chaque bande. La valeur de votre mesure de fond devrait être le plus grand nombre, car il est plus lumineux que les bandes ombragées de votre film de Western blot. Soustraire les valeurs de mesure de la bande de la valeur de fond pour déterminer leur densité relative. Par exemple, si votre valeur de fond est de 200 et que vous avez quatre bandes avec des valeurs de luminosité de 150, 170, 180 et 190, les valeurs finales pour ces quatre groupes sont 50, 30, 20 et 10.

17 Comparer les groupes expérimentaux utilisant toutes les analyses statistiques que vous souhaitez appliquer. La plupart des expériences utilisent une technique appelée ANOVA (analyse de variance) pour comparer les valeurs entre les groupes. Beaucoup de paquets de statistiques telles que PSAW ont intégré dans les procédures statistiques pour exécuter ANOVAs sur les données correctement formatées.

Conseils et avertissements

• Mélangez votre tampon de blocage immédiatement avant de commencer lavages. Le tampon de blocage peut être facilement contaminée et ne reste frais pendant plusieurs jours.
• Toujours vérifier la fiche de données de sécurité pour déterminer les procédures de sécurité lors de la manipulation des produits chimiques.
• Ne jamais exposer un film non développé à la lumière. Cela endommagerait le film.

Le test Western Blot, également appelé immunoblot, est un test pour une protéine spécifique dans un mélange de protéines. L'essai par transfert de Western est effectuée après l'électrophorèse sur gel ou un essai par immunosorbant (ELISA) lié à une enzyme, et on utilise les anticorps pour identifier des protéines spécifiques.

SDS-PAGE

Sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl (SDS-PAGE) est un test couramment utilisé pour séparer les protéines pour une utilisation dans le Western blot. Les protéines sont séparées en poids et des propriétés électriques qui se déplacent à travers une matrice de gel.

ELISA

Le test ELISA utilisant des enzymes ou des anticorps fixés à une surface solide pour créer la surface de test. Un échantillon est ensuite ajoutée à la surface d'essai. Des anticorps ou des enzymes réagissant ou attachés à des protéines indique un résultat positif.

western Blot

L'essai par transfert de Western est effectuée après l'électrophorèse sur gel. Les protéines séparées sont transférées (ou effacés) sur nitrocellulose ou de nylon membranes et identifiés par des anticorps spécifiques qui sont marqués par une protéine secondaire.

Confirmation de test positif

Le test Western blot est utilisé pour confirmer les résultats positifs soit électrophorèse sur gel ou des tests ELISA. Le test Western blot peut identifier des protéines plus spécifiquement et peut exclure les faux positifs.

Maladies

Le test Western blot est généralement utilisé pour confirmer les résultats de tests positifs pour le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et la maladie de Lyme.

Les chercheurs biomédicaux et les laboratoires médicaux trouvent souvent qu'il est nécessaire de déterminer si une protéine donnée est présente dans un échantillon. Transfert de Western est une technique qui offre un moyen pour détecter la présence d'une protéine dans un échantillon de tissu ou d'extrait.

Caractéristiques

En Western blot, les protéines provenant d'un échantillon sont séparés en fonction de leur taille et de la charge à travers une électrophorèse sur gel de technique appelée. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose et une solution contenant un anticorps est ajouté. L'anticorps est spécifique et ne se lier à la protéine d'intérêt. Ensuite, une solution contenant un deuxième anticorps spécifique pour le premier anticorps est ajouté. Le second anticorps est marqué avec un isotope radioactif, de sorte que si la protéine d'intérêt est dans l'échantillon, le marqueur radioactif marquera sa présence.

Fonction

Western blot est utilisé dans la recherche scientifique et le diagnostic médical. En médecine, il peut être utilisé pour tester la maladie de Lyme ou le VIH dans des échantillons de sang. Dans la recherche, il est souvent utilisé pour déterminer si une protéine particulière est présente dans un type cellulaire donné et la quantité de la protéine peuvent être présents.

Considérations

Pour des examens médicaux, comme la maladie de Lyme, le transfert de Western est utilisé conjointement avec une technique appelée technique ELISA (dosage immuno-enzymatique). ELISA peut parfois donner des résultats faussement positifs. Western blot permet de confirmer les résultats des tests ELISA.

Western blot, une technique d'analyse utilisée pour identifier une protéine spécifique dans un échantillon donné, utilise la capacité d'une enzyme ou un anticorps primaire marqué par fluorescence se lier à son antigène spécifique. Il est un processus en trois étapes commençant par électrophorèse sur gel, suivie par une membrane blot et de sondage avec des anticorps. la détection de la protéine peut être directe ou indirecte avec celle-ci en utilisant un anticorps secondaire marqué dirigé contre le premier. Bien accepté comme une technique d'analyse de protéines de routine, western blot a des limites ainsi que des avantages.

Avantage: Sensibilité

Un des plus grands arguments en faveur de western blot est sa sensibilité. En raison de sa capacité à détecter aussi peu que 0,1 ng de protéine dans un échantillon, cette technique peut théoriquement servir d'outil diagnostique précoce et efficace, détecter la moindre réponse immunogène d'un virus ou d'une bactérie dans un échantillon de patient. Un buvardage de western en outre indirecte repose sur cette sensibilité de la capacité de l'anticorps secondaire pour amplifier l'intensité du signal détecté par le système d'imagerie. signifie une plus grande sensibilité que moins d'anticorps sont nécessaires pour les tests, ce qui réduit les coûts de laboratoire de manière significative.

Avantage: Spécificité

La technique western blot doit sa spécificité à deux grands facteurs contributifs. Tout d'abord, l'électrophorèse sur gel trie un échantillon dans les protéines de taille différente, la charge et la conformation. Ce processus en lui-même est un grand pas vers la détection, sous forme de bandes formées dans le gel donnent déjà des indices sur la taille de la protéine ou d'un polypeptide d'intérêt. La spécificité de l'interaction anticorps-antigène sert le deuxième facteur important. Étant donné que les anticorps spécifiques présentent une affinité pour des protéines spécifiques, le procédé est capable de détecter sélectivement une protéine cible, même dans un mélange de 300.000 protéines différentes.

Inconvénient: Enclin à des résultats faux ou subjectifs

En dépit de sa sensibilité et de spécificité, un western blot peut encore produire des résultats erronés. Un des résultats faussement positifs lorsqu'un anticorps réagit avec une protéine non-prévue, ce qui arrive souvent quand un patient testé pour le VIH arrive à avoir la tuberculose ou un certain nombre d'infections parasitaires. Un faux-négatif, d'autre part, peut facilement entraîner des protéines plus grandes ne sont pas suffisamment de temps pour transférer correctement à la membrane. Une mauvaise blot et le traitement produisent souvent biaisés, fané, ou même plusieurs bandes, ce qui rend les résultats des tests sous réserve de l'interprétation du technicien.

Inconvénient: coût élevé et la demande technique

Le coût d'un western blot est un composite des grandes dépenses individuelles pour les anticorps marqués, les analystes qualifiés et de matériel de laboratoire. Un processus délicat, western blot exige de la précision dans toutes les étapes pour l'identification correcte des constituants d'un échantillon. Une erreur mineure dans la concentration de réactif ou la période d'incubation peut être désastreux pour l'ensemble du processus. Enfin, l'équipement nécessaire pour la détection et l'imagerie - chimioluminescent, ou des systèmes fluorescents, radioactifs détection laser - peut être trop coûteux pour l'unité de microbiologie moyenne.

Western blot est un moyen relativement simple de visualiser des protéines spécifiques de lysat cellulaire - le mélange de molécules de rafale ou de cellules "lysées". Souvent, cependant, les débutants ont une faible chance d'obtenir cette technique pour fonctionner correctement. Une source possible d'erreur implique le transfert des protéines sur la membrane de nitrocellulose ou de PVDF lors du transfert électrophorétique.

Notions de base

Après électrophorèse, le gel de polyacrylamide est retiré de la cuve tampon et les protéines qu'il contient sont transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF. La méthode la plus courante pour le transfert de protéines est la méthode semi-sèche. Dans cette approche, un papier filtre et la membrane sont placés sur l'anode, - une électrode chargée positivement. Un autre morceau de papier filtre est placé au-dessus du gel, suivi par la cathode. Les protéines ont déjà été dénaturé et sont revêtues d'un composé appelé le dodécylsulfate de sodium, de sorte qu'ils ont tous une charge négative. Par conséquent, la chute de tension entre les deux électrodes attire les protéines du gel et dans la membrane. Plusieurs facteurs influent sur l'efficacité de ce transfert.

Courant

Bien que la tension et le courant sont bien sûr liés par la loi d'Ohm (V = IR), le courant est un plus important que la tension dans ce cas. Si le courant est trop élevé, il pourrait causer une surchauffe. En outre, un courant élevé peut également provoquer des protéines plus petites à se déplacer aussi rapidement qu'ils ne possèdent pas la possibilité de se lier à la membrane. Choisissez un tampon qui a une densité de charge inférieure pour empêcher le courant de devenir trop élevé; Tris-Glycine est un bon exemple. Assurez-vous aussi de tamponner jusqu'à tout excès de tampon se trouvant autour de la pile de papier filtre / gel. Les piscines ou les éclaboussures de tampon pourraient relier les électrodes directement, créant un court.

Membrane

Vous pouvez acheter des membranes avec des tailles de pores; la taille que vous choisissez dépend de la taille des protéines que vous voulez étudier. 0,45 micromètre est un choix commun, bien que si le poids moléculaire de votre protéine est inférieure à 20 kilodaltons, vous devrez peut-être une membrane avec une taille de pores encore plus petits. Également choisir soigneusement au moment de décider quel type de membrane que vous voulez. PVDF est plus cher que la nitrocellulose, mais il est moins fragile et vous pouvez sonder à plusieurs reprises, alors que les membranes nitrocellulose peuvent généralement seulement être sondé une fois.

Buffer Chemicals

Y compris le méthanol dans votre tampon est importante, car elle aide à éliminer le SDS de vos protéines de sorte qu'ils peuvent se lier à la membrane. Ajout trop de méthanol, cependant, enlève le SDS trop tôt, avant que les protéines ont laissé le gel, ce qui pourrait les amener à agglutinent et se coincer dans le gel. Selon le type d'expérience et le protocole, 20 pour cent de méthanol est une concentration raisonnable, mais il est important d'inclure une faible concentration de SDS ainsi. Cette aide supplémentaire SDS éluer les protéines, ou extraire, à partir du gel.

Protein Charge et autres facteurs

Comme le méthanol dissout le SDS, les protéines se chargent moins négativement. Dans certaines situations, cela peut poser un problème potentiel, car les protéines migrent plus lentement que leur charge nette devient moins négative. Si vous trouvez vos protéines ne sera pas correctement transférer pour cette raison, vous pouvez essayer un tampon avec un pH plus élevé, comme CAPSO (acide sulfonique 3-N-cyclohexylamino-2-hydroxypropane), étant donné que vos protéines auront une charge plus négative à la pH plus élevé. Un autre facteur à considérer est le moment du transfert; protéines plus grandes se déplacent plus lentement, vous devez donc prévoir suffisamment de temps pour vos protéines pour transférer à la membrane.

Western Blot ou immunotransfert des protéines, est une procédure qui permet de détecter la présence de protéines spécifiques dans un échantillon. Le transfert des protéines sur une membrane après électrophorèse permet la détection de protéines cibles; Les enzymes se fixent les anticorps liés à la protéine individuelle et produire une couleur lorsqu'il est exposé à un substrat spécifique. Décapage une membrane Western blot élimine physiquement les protéines résiduelles et des anticorps.

Instructions

1 Placer 10 ml de Tween 20, 15 grammes de glycine et 1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans un flacon en verre de 1 litre. Ajuster le pH à 2,2 au moyen d'acide chlorhydrique, en mesurant au moyen d'un pH-mètre. Ajouter de l'eau ultrapure suffisante pour porter le volume total à 1 litre. Utilisez ce premier tampon.

2 Placez la membrane utilisée dans le plat en verre. Ajouter une quantité suffisante du tampon produite dans l'étape précédente pour recouvrir la membrane. Après 10 minutes, jeter le tampon utilisé et ajouter du tampon frais. Encore une fois, attendez 10 minutes et jeter le tampon utilisé.

3 Verser tampon PBS assez dans le plat de verre pour couvrir la membrane. Attendre 10 minutes et jeter le tampon. Verser le tampon PBS frais dans le plat en verre et attendre encore 10 minutes. Jeter le tampon utilisé.

4 Verser tampon TBST assez dans le plat de verre pour couvrir la membrane. Attendez cinq minutes et jeter le tampon utilisé. Verser tampon TBST frais dans le plat en verre. Encore une fois, attendez cinq minutes, et jeter le tampon utilisé.

5 Testez l'efficacité de la procédure de décapage en exposant la membrane à des anticorps qui se fixeront à des protéines résiduelles, comme l'exige la procédure spécifique de Western blot vous suivez. Exposer les anticorps à une solution d'indicateur. S'il n'y a pas de réaction (indiquée par une absence de changement de couleur), la membrane est prête pour être réutilisée.

Conseils et avertissements

• Incuber la membrane à la température ambiante pendant toute la procédure.
• Manipuler la membrane avec des pinces stériles pour éviter toute contamination.
• Les produits chimiques utilisés dans cette procédure peuvent causer des blessures. Porter un manteau de laboratoire, des lunettes et des gants tout au long de la procédure.
• Exécuter la procédure dans un environnement stérile, tel qu'une hotte à flux laminaire, afin d'éviter la contamination de la membrane.

Western blots sont un type de technique d'analyse qui peut être utilisé ou demandé par les cliniciens pour arriver à un diagnostic. Western blots travaillent en séparant l'ensemble des différentes protéines dans un échantillon, habituellement un échantillon de sang. Une fois que ces protéines ont été séparées, les substances appelées anticorps peuvent être utilisés pour détecter des protéines spécifiques. La présence ou l'absence de ces protéines spécifiques, ou les niveaux de la protéine détectée, vont conduire au diagnostic. Si vous utilisez un Western blot de diagnostic, le clinicien devrait demander le test, en utilisant un laboratoire fiable pour cette analyse.

Instructions

La lecture des résultats Western Blot

1 Examinez les résultats reçus du clinicien. En fonction de l'infection ou la maladie étant testés pour, il peut y avoir plusieurs bandes différentes rapportées dans le Western blot, chacun avec soit positif, soit un résultat négatif. Il peut y avoir quelques bandes rapportées pour le Western blot qui ne sont pas le signe d'un résultat. Assurer l'information fournie par les cliniciens qui informe blots sont essentiels.

2 Recherchez les tailles des bandes. Ceux-ci seront représentées par un nombre, soit suivi par «kDa» ou précédés par "p." Ceci est la taille de la protéine qui a été détectée et l'échelle à laquelle les protéines sont séparées dans un Western Blot. Ce sont ces bandes numérotées différemment qui représentent différentes protéines et déterminera un résultat positif ou non.

3 Déterminer quelles bandes ont un résultat positif et ce que cela peut signifier. Par exemple, avec le test pour la maladie de Lyme, il existe plusieurs groupes différents qui peuvent produire un résultat positif, et l'un quelconque de ceux-ci se traduira par un résultat positif. D'autres tests peuvent simplement produire des bandes non significatives. Ceux-ci ne peuvent pas être rapportés, mais il est clair d'assurer quels sont les groupes importants. bandes spécifiques qui montrent un résultat positif signifie un résultat positif pour l'infection qui a été testé pour.

4 Discutez des résultats et des préoccupations ou des questions avec un clinicien. Un résultat positif peut nécessiter un traitement, et les conséquences de ce qui devrait également être discuté avec le médecin qui a ordonné le test de diagnostic Western blot.

Conseils et avertissements

• Si l'un des résultats d'un Western blot reste incertaine, consulter un médecin.

Transfert de Western est une technique de laboratoire pour la détection de l'abondance des protéines d'intérêt. Il est un procédé précis le plus souvent utilisé pour comparer les niveaux de protéines de deux échantillons, l'un traité d'une certaine manière et à une non traitée et utilisée comme témoin. La détection des protéines est basée sur leur liaison à des anticorps spécifiques et est efficace pour assurer la détection de seulement votre protéine d'intérêt donc.

Instructions

Protocole Western Blot

1 Des échantillons de protéines séparées par le poids moléculaire en utilisant une électrophorèse sur gel. Sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl (SDS-PAGE) est le plus souvent utilisé.

2 Faire tremper les papiers blot et des membranes de nitrocellulose dans le méthanol, puis passer à transférer tampon.

3 Transfert des protéines du gel vers une membrane de nitrocellulose par l'assemblage d'un sandwich d'une feuille de transfert, une membrane de nitrocellulose, le gel, et d'un autre papier de transfert dans la cellule de transfert et de transformer la cellule de transfert sur la tension suggérée. Les protéines sont transférées du gel sur la membrane dans le même schéma de séparation.

4 Jeter les papiers blot et gel. Incuber la membrane avec 5 pour cent de lait pour lier les zones collantes sur la nitrocellulose qui pourrait interférer avec la détection de votre protéine. Laisser incuber pendant au moins une heure. Le lait est généralement dissous dans 1X Tris-solution saline tamponnée Tween-20 (TBST), mais peut varier en fonction de votre protocole.

5 Verser le lait et incuber la membrane pendant une nuit à 4 degrés Celsius avec un anticorps primaire choisi de se lier à votre protéine d'intérêt. Consultez la fiche d'information du produit pour quelle solution pour dissoudre votre anticorps (habituellement le lait) et dans quelle concentration.

6 Lavez votre membrane avec un tampon de lavage au moins 5 fois pendant 5 minutes à chaque fois. Ceci garantira que tout anticorps primaire non lié est éliminé par lavage de la membrane afin de ne pas interférer avec les lectures. 1X TBST est un tampon de lavage couramment utilisé.

7 Incuber votre membrane une heure à température ambiante avec un anticorps secondaire qui reconnaîtra votre anticorps primaire. Les anticorps secondaires sont identifiés par quelles espèces ils interagissent avec, comme anti-souris ou anti-lapin. Choisissez l'anticorps secondaire qui correspond à l'espèce source de votre anticorps primaire. Veiller à l'anticorps secondaire est conjugué à une enzyme peroxydase de raifort et de vérifier avec le fabricant pour les conditions et les concentrations de dissolution.

8 Laver la membrane avec le tampon de lavage de la même manière que ci-dessus pour assurer l'enlèvement de tout anticorps secondaire non lié. Cela permet d'éviter des niveaux de bruit de fond.

9 Incuber votre membrane avec une chimioluminescence amplifiée (ECL) réactif pendant 5 minutes à température ambiante. des kits d'ECL sont munis de deux composants, un composant de luminol et un composant de peroxydase. Ces deux sont mélangés ensemble avant l'addition à votre membrane. La peroxydase de raifort sur votre anticorps secondaire lié sera cliver le luminol de la ECL provoquant la membrane pour émettre de la lumière où l'anticorps secondaire est lié.

dix Sceller votre membrane dans une couverture de feuille de plastique et de bande dans une cassette de film pour le développement.

11 Exposez votre membrane à un film dans une pièce sombre et passer à travers le développeur de visualiser le signal de votre protéine. Il est important d'obtenir suffisamment de bandes sombres pour voir la protéine, mais pas si sombre qu'ils sont indiscernables. Variez les temps d'exposition pour obtenir un signal clair.

12 Calculer l'abondance relative de vos échantillons de protéines en utilisant un programme pour mesurer densitométrie ou l'obscurité de chaque bande.

Dépannage Western Blot

13 Survolez votre blot-membrane-gel-blot sandwich avec une pipette en verre avant de commencer le transfert. Cela permettra d'éliminer les bulles d'air qui interfèrent avec le transfert de protéines adéquat.

14 Varier la concentration de votre anticorps primaire si vous obtenez un signal faible qui ne peut être détectée après des temps d'exposition longs. Une concentration plus élevée d'anticorps primaire favorisera plus la liaison à votre protéine.

15 Variez la concentration de votre anticorps secondaire s'il y a un niveau élevé de bruit de fond sur votre blot. Une concentration d'anticorps secondaire peut aider à réduire la liaison non spécifique.

16 Lavez votre membrane plus longtemps pour aider à l'élimination du bruit de fond.

17 Bloc avec le lait pendant plus de 1 heure si les films développés contiennent beaucoup de bruit de fond. En outre, le sérum normal de l'anticorps secondaire, l'animal hôte peut être utilisé pour le blocage.

Conseils et avertissements

• Toujours lire les étiquettes de tous les réactifs utilisés et d'utiliser et de les éliminer selon les spécifications. Toujours porter un équipement de protection individuelle tels que gants, une blouse de laboratoire, et des lunettes lorsque vous travaillez dans le laboratoire.

Transfert de Western est une technique de biotechnologie pour la détection d'une protéine spécifique dans un échantillon. Elle implique la séparation des protéines par la taille et la charge, au moyen d'une procédure appelée électrophorèse sur gel; de les transférer à une membrane de PVDF ou de nitrocellulose; et l'addition d'anticorps primaires. Si la protéine d'intérêt est présent, les anticorps se lient à elle.

Enfin, le chercheur ajoute des anticorps secondaires qui se lient aux anticorps primaires. Les anticorps secondarty portent une enzyme qui émet de la lumière en présence de la protéine; la quantité de lumière qu'ils émettent reflète la quantité de protéine dans l'échantillon.

Restore est une marque de blot tampon stripping que vous pouvez utiliser pour supprimer les anticorps primaires et secondaires si vous avez besoin de re-sonder l'échantillon.

Instructions

1 Réchauffez la bouteille de restauration Western Blot Stripping Buffer 21059 jusqu'à ce qu'il soit à la température ambiante. En sortant de la bouteille pendant plusieurs heures ou toute la nuit, va l'amener à la température ambiante. Si nécessaire, vous pouvez le vérifier avec un thermomètre.

2 Laver la tache avec un tampon de lavage pour éliminer tout substrat chimioluminescent qui reste de la première sonde. Ajouter suffisamment de restauration Western Blot Stripping Buffer complètement mouiller le blot. Le fabricant recommande 20 millilitres comme une quantité appropriée pour un transfert de 8 par 10 centimètres.

3 Incuber la tache avec le tampon à la température ambiante. Si les anticorps que vous avez utilisé pour sonder le blot étaient une affinité élevée, vous devrez peut incuber la tache à la température légèrement plus élevée de 37 degrés Celsius (98,6 degrés Fahrenheit) et laisser plus de temps. En général, cependant, 5 à 15 minutes devraient être suffisantes pour éliminer à la fois primaire et secondaire des anticorps.

4 Ajouter le substrat de peroxydase de raifort chimioluminescente à la tache, et placer une feuille de film photographique sur la membrane. Le film change de couleur chaque fois que la lumière frappe. Si le film photographique n'a détecté aucune lumière émise par l'échantillon après 5 minutes, vous avez supprimé l'anticorps secondaire et son enzyme conjugué.

5 Ajouter l'anticorps secondaire à la tache. Laver la tache dans un tampon de lavage et de l'exposer à nouveau pour un film photographique, tout comme à l'étape 4.

Si vous ne voyez pas un changement après 5 minutes, vous avez supprimé l'anticorps primaire et peut re-sonder le blot pour valider vos résultats précédents.

Si vous n'avez pas supprimé avec succès soit l'anticorps primaire ou secondaire, re-incuber le blot dans Supprimer Western Blot Stripping Buffer, comme décrit dans les étapes 2 et 3. Laissez encore 5 à 15 minutes pour assurer l'élimination des deux anticorps primaires et secondaires , puis répétez les étapes 4 et 5.

Conseils et avertissements

• Il est important de laisser incuber la tache assez longtemps pour enlever tout l'anticorps primaire et secondaire, mais pas assez longtemps pour endommager la protéine d'intérêt. En général, 5 à 15 minutes devraient suffire; en fonction de la protéine que vous travaillez avec, cependant, il peut y avoir des exceptions.
• Ne jamais effectuer une expérience de ce type sans porter un équipement approprié de sécurité (par exemple, des lunettes de protection chimique, des gants, une blouse de laboratoire) et en suivant les protocoles et les procédures de sécurité de votre laboratoire.