Glutathion ou GSH est une protéine présente dans les plantes et les animaux. Il travaille pour aider les réactions enzymatiques dans la détoxication des contaminants environnementaux. De plus, il facilite le transport d'acides aminés au sein des cellules et contribue à maintenir les réactions de réduction des protéines sulfhydryle. protocoles GSH Assay utilisent GSH des tampons, des normes, substrat, des enzymes et des réactifs. En suivant la procédure spécifique est pertinente à l'issue de l'essai.
Méthode de recyclage Enzymatic
Procédé de recyclage enzymatique, pour le GSH, utilise glutathion réductase pour quantifier GSH. Ce protocole est spécifiquement pour le plasma, échantillons de tissus ou de cellules en culture. Ajouter le DTNB réactif (acide 5-5'-dithio-bis-2-nitrobenzoïque) à GSH. Le groupe sulfhydryle GSH réagit avec le réactif et produit un acide jaune appelé 5-thio-2-nitrobenzoïque (TNB). Ajouter glutathion réductase au mélange d'acide et GSH à recycler GSH et produire plus d'acide. Dans cette procédure, le taux de production d'acide est proportionnelle à la réaction de recyclage de GSH; par conséquent, mesurer l'absorbance de l'acide TNB en utilisant un spectrophotomètre. L'absorbance fournit une estimation de la quantité réelle de GSH dans l'échantillon.
Dosage des cellules hépatiques glutathione
Ce protocole analyse la quantité de GSH dans l'hépatocarcinome humain (cancer du foie) des cellules. Pour mener à bien cette procédure, utilisez la méthode colorimétrique pour la détermination GSH pour réduire et oxyder GSH. Réduire le GSH en utilisant 5-5'-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque ou DTNB) pour former le
Produit d'acide 2-nitro-5-thiobenzoïque de couleur et de glutathion oxydé (GSSG). Utilisez la glutathion réductase pour réduire GSSG pour former à nouveau GSH. Afin de mesurer la quantité de GSH dans les cellules du foie, lire l'échantillon à 415 absorbance cinétiquement sur un lecteur de microplaques.
cellule apoptose
Dans ce protocole, GSH est utilisée pour détecter l'apoptose cellulaire (mort) par la mesure de la diminution de GSH réduit. Une diminution de la concentration de GSH cellulaire est un indicateur de la mort cellulaire. Colorer les cellules échantillons avec vert Thiolite non fluorescent. accumule Le vert Thiolite dans le cytosol (cellule plasma) et des mitochondries (centrale électrique) de la cellule. En utilisant un cytomètre de flux à 490/520 nm pour visualiser la quantité de GSH dans les cellules.
Concentration totale de GSH dans animales et végétales échantillons
Mesurer la concentration du total GSH sous la forme à la fois réduite et oxydée dans différents échantillons d'animaux et de plantes. Ajouter le réactif de type thiol général, 5-5'-dithiobis [acide 2-nitrobenzoïque]. Le réactif thiol réagit avec GSH pour former 412 nm chromophore, l'acide 5-thionitrobenzoïque (TNB) et GS-TNB. Ajouter la glutathion réductase et du bêta-nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) pour réduire GS-TNB. Le glutathion publiera également une seconde molécule TMB et recycler le GSH. En outre, tout GSH oxydé (GSSG) présents dans le mélange fromed de la réaction de disulfure est également réduit en GSH. Utilisez un lecteur de microplaques à 405 nanomètres pour lire le niveau d'absorption et d'indiquer la concentration totale de GSH.