Les biochimistes ont souvent besoin d'un moyen de séparer les protéines par la taille pour l'analyse. SDS-polyacrylamide électrophorèse sur gel, ou SDS-PAGE, offre un moyen de faire exactement cela. Les échantillons sont séparés sur un gel à base de polyacrylamide contenant un détergent appelé SDS; en se liant aux protéines dénaturées, le SDS assure qu'ils ont tous une charge négative. SDS-PAGE est une technique courante, mais en fonction de votre laboratoire et le type d'expérience, il peut y avoir quelques variations.
Gels
Plus la concentration d'acrylamide dans le gel, les plus petits pores dans le gel sera, ainsi que les protéines plus lentement va se déplacer. Différentes concentrations d'acrylamide sont préférables pour la séparation des protéines dans certaines gammes de poids moléculaire; 10 pour cent des gels d'acrylamide, par exemple, sont bonnes pour la séparation de protéines ayant des masses moléculaires dans la plage de 30 à 100 kilodaltons (kDa). Il sert à être que tous les laboratoires versaient leurs propres gels, mais de nombreux laboratoires utilisent maintenant des gels préfabriqués à la place. Si vous versez votre propre gel, il est important de se rappeler que l'acrylamide est une neurotoxine que vous pouvez absorber par la peau, il est donc important d'être prudent.
Installer
Le gel est divisé en deux sections: le gel d'empilement et le gel de roulement. Le gel d'empilement se trouve au sommet du gel en cours d'exécution, et les deux sont orientés verticalement de telle sorte que, lorsque le courant électrique est appliqué, les protéines se déplaceront vers le bas vers le fond du réservoir. Le terminal au fond de la cuve est positive, de sorte qu'il attire les protéines chargées négativement. Une fois chargé dans le réservoir, le gel est baigné dans un tampon.
Stacking Gel
Gel d'empilement a à la fois une concentration d'acrylamide plus faible et un pH inférieur à courir gel. Le pH inférieur provoque un acide aminé appelé glycine pour ramasser des ions d'hydrogène, de sorte que sa charge nette devient plus positive et il se déplace plus lentement. Pendant ce temps, les ions chlorure dans l'échantillon course devant. En fin de compte, cette séparation crée des zones de tension plus élevée et plus faible dans le gel d'empilement, ce qui comprime les protéines présentes dans l'échantillon en une ligne mince. Cette compression assure une meilleure séparation dans le gel en cours d'exécution ci-dessous.
Fixation & buvard
Certains laboratoires ont des pointes de micropipette extra-minces spéciaux juste pour le chargement des échantillons dans les puits sur des gels de SDS-PAGE. Ce ne sont pas absolument nécessaires, cependant, et vous pouvez utiliser une pointe de pipette ordinaire aussi longtemps que vous êtes prudent. Lors du chargement des puits, il est important d'éviter d'introduire des bulles. La plupart des protocoles comprennent un colorant de suivi avec les échantillons de sorte que vous pouvez suivre la progression de vos protéines sur le gel en cours d'exécution. Une fois que la procédure est terminée, selon le protocole, vous pouvez soit fixer le gel avec du méthanol, l'acide acétique et de Coomassie colorant bleu brillant, ou vous pouvez faire un Western blot en transférant les protéines du gel à une membrane - soit nitrocellulose ou PVDF - pour une analyse ultérieure.