Western blot est un moyen relativement simple de visualiser des protéines spécifiques de lysat cellulaire - le mélange de molécules de rafale ou de cellules "lysées". Souvent, cependant, les débutants ont une faible chance d'obtenir cette technique pour fonctionner correctement. Une source possible d'erreur implique le transfert des protéines sur la membrane de nitrocellulose ou de PVDF lors du transfert électrophorétique.
Notions de base
Après électrophorèse, le gel de polyacrylamide est retiré de la cuve tampon et les protéines qu'il contient sont transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF. La méthode la plus courante pour le transfert de protéines est la méthode semi-sèche. Dans cette approche, un papier filtre et la membrane sont placés sur l'anode, - une électrode chargée positivement. Un autre morceau de papier filtre est placé au-dessus du gel, suivi par la cathode. Les protéines ont déjà été dénaturé et sont revêtues d'un composé appelé le dodécylsulfate de sodium, de sorte qu'ils ont tous une charge négative. Par conséquent, la chute de tension entre les deux électrodes attire les protéines du gel et dans la membrane. Plusieurs facteurs influent sur l'efficacité de ce transfert.
Courant
Bien que la tension et le courant sont bien sûr liés par la loi d'Ohm (V = IR), le courant est un plus important que la tension dans ce cas. Si le courant est trop élevé, il pourrait causer une surchauffe. En outre, un courant élevé peut également provoquer des protéines plus petites à se déplacer aussi rapidement qu'ils ne possèdent pas la possibilité de se lier à la membrane. Choisissez un tampon qui a une densité de charge inférieure pour empêcher le courant de devenir trop élevé; Tris-Glycine est un bon exemple. Assurez-vous aussi de tamponner jusqu'à tout excès de tampon se trouvant autour de la pile de papier filtre / gel. Les piscines ou les éclaboussures de tampon pourraient relier les électrodes directement, créant un court.
Membrane
Vous pouvez acheter des membranes avec des tailles de pores; la taille que vous choisissez dépend de la taille des protéines que vous voulez étudier. 0,45 micromètre est un choix commun, bien que si le poids moléculaire de votre protéine est inférieure à 20 kilodaltons, vous devrez peut-être une membrane avec une taille de pores encore plus petits. Également choisir soigneusement au moment de décider quel type de membrane que vous voulez. PVDF est plus cher que la nitrocellulose, mais il est moins fragile et vous pouvez sonder à plusieurs reprises, alors que les membranes nitrocellulose peuvent généralement seulement être sondé une fois.
Buffer Chemicals
Y compris le méthanol dans votre tampon est importante, car elle aide à éliminer le SDS de vos protéines de sorte qu'ils peuvent se lier à la membrane. Ajout trop de méthanol, cependant, enlève le SDS trop tôt, avant que les protéines ont laissé le gel, ce qui pourrait les amener à agglutinent et se coincer dans le gel. Selon le type d'expérience et le protocole, 20 pour cent de méthanol est une concentration raisonnable, mais il est important d'inclure une faible concentration de SDS ainsi. Cette aide supplémentaire SDS éluer les protéines, ou extraire, à partir du gel.
Protein Charge et autres facteurs
Comme le méthanol dissout le SDS, les protéines se chargent moins négativement. Dans certaines situations, cela peut poser un problème potentiel, car les protéines migrent plus lentement que leur charge nette devient moins négative. Si vous trouvez vos protéines ne sera pas correctement transférer pour cette raison, vous pouvez essayer un tampon avec un pH plus élevé, comme CAPSO (acide sulfonique 3-N-cyclohexylamino-2-hydroxypropane), étant donné que vos protéines auront une charge plus négative à la pH plus élevé. Un autre facteur à considérer est le moment du transfert; protéines plus grandes se déplacent plus lentement, vous devez donc prévoir suffisamment de temps pour vos protéines pour transférer à la membrane.