Western blots sont une technique d'électrophorèse sur gel d'analyser la teneur en protéines d'un échantillon biologique. Cette technique est une procédure standard dans les laboratoires de recherche biologique et peut également être utilisé en médecine légale ou de diagnostic biomédical.
Western blots ont la protéine purifiée à partir d'un échantillon de tissu et la soumettre à un processus appelé SDS-PAGE, lorsque les protéines sont séparées en poids, en utilisant un courant électrique. Une fois que les protéines sont séparées, elles peuvent être transférées à un difluorure de polyvinyle (PVDF) et analysées pour différentes protéines d'intérêt.
Instructions
Développer un Gel Western blot pour une protéine d'intérêt
1 Laver soigneusement la membrane de PVDF en solution TBST. Placer la membrane dans un récipient rectangulaire remplie avec du TBST et la placer sur un agitateur basculant ou à la rotation à basse vitesse (80 à 90 Hz) pendant 10 minutes. Dump de la TBST dehors et répéter ce lavage.
2 Laver la membrane dans un tampon de blocage. Versez délicatement la solution de TBST out et verser une quantité équivalente de tampon de blocage dans le récipient. Placer le récipient sur un agitateur à faible vitesse pendant une heure.
3 Mélangez votre anticorps primaire en attendant que le tampon de blocage pour terminer. Vérifiez votre anticorps pour voir ce que la dilution est recommandé par le fabricant et diluer en conséquence. Par exemple, si votre anticorps doit être mélangé dans une dilution de 1: 5000, vous pouvez mesurer 10 ml de tampon de blocage et ajouter 2 pi (microlitres) de l'anticorps primaire.
4 Verser le tampon de blocage et ajouter la solution d'anticorps primaire au récipient. La quantité de temps nécessaire pour incuber l'anticorps primaire avec la membrane de PVDF variera avec l'échantillon d'anticorps et les tissus. La procédure la plus courante consiste à placer la membrane sur un agitateur à vitesse lente à 4 degrés C (dans un réfrigérateur) pour 16 à 18 heures. Votre anticorps devrait venir avec un temps d'incubation recommandé.
5 Rincer la membrane de PVDF. Verser l'anticorps primaire et à rincer la membrane pendant 10 minutes dans du TBST à température ambiante. Répéter cette étape de lavage, deux ou trois fois.
6 Incuber la membrane dans un anticorps secondaire. Votre anticorps secondaire est livré avec une dilution recommandée. Par exemple, si la dilution recommandée est de 1: 10.000, vous pouvez ajouter 1 pi à 10 ml de tampon de blocage. Assurez-vous que votre anticorps secondaire est marqué "HRP-conjugué" parce que d'autres anticorps peuvent ne pas fonctionner correctement avec des kits ECL.
7 Développer la membrane de PVDF en utilisant un système ECL ou de chimioluminescence comparables. Vérifiez les instructions qui viennent avec votre kit ECL pour voir comment mélanger la solution de développement et comment développer correctement la membrane.
Développer le PVDF Membrane
8 Exposer un film à la membrane. Dans les 10-15 minutes de ECL développer, mettre la membrane de PVDF à une chambre noire. Dans l'obscurité totale, exposer un film vierge à la membrane et le placer dans la machine de développement de la chambre noire.
9 Une fois que le film sort du développeur, allumer les lumières et voir si le film est suffisamment développé. Si le film est trop léger, vous aurez besoin d'exposer un nouveau film pour une période plus longue. Si le film est trop sombre, vous pouvez essayer d'exposer un autre film pendant une minute ou 30 secondes.
dix Notez le temps d'exposition qui a créé un film bien développé. Vous pouvez utiliser ce temps pour tous les essais ultérieurs de cette procédure.
11 Numériser le film développé dans un ordinateur en utilisant votre scanner. Avec la plupart des scanners, vous pouvez placer le film sur la vitre du scanner et appuyer sur un bouton. Consultez la documentation qui accompagne votre scanner pour déterminer si cela est la procédure appropriée. Une fois que le film est balayé dans, enregistrer l'image avec un nom de fichier descriptif que vous serez en mesure de reconnaître plus tard.
12 Ouvrez l'image enregistrée dans le programme ImageJ. ImageJ est développé par le National Institutes of Health (NIH) et est disponible gratuitement en ligne.
Comparez les bandes dans les films développés
13 Obtenir une mesure de fond. Faites une sélection rectangulaire autour de la plus grande bande dans le Western blot en utilisant l'outil de sélection (la première icône dans la barre d'outils). Déplacez ensuite le rectangle, une zone peu développée vide du film. Maintenez la touche Ctrl + M pour mesurer l'obscurité de fond.
14 Déplacez le rectangle à la première bande sur le film et appuyez à nouveau sur Control-M. Répétez cette en séquence pour toutes les bandes sur le film que vous souhaitez analyser.
15 Copiez les données de la bande. Lorsque vous commencez à mesurer, une fenêtre "Résultats" apparaîtra. Une fois que vous avez terminé la mesure, mettre en évidence toutes les données de mesure et appuyez sur Ctrl-C pour le copier. Ouvrez votre programme de feuille de calcul et appuyez sur Ctrl-V pour coller les données de mesure. étiqueter soigneusement toutes les données collées et enregistrez le fichier de données lorsque vous avez terminé la mesure de tous les films.
16 Déterminer la densité de chaque bande. La valeur de votre mesure de fond devrait être le plus grand nombre, car il est plus lumineux que les bandes ombragées de votre film de Western blot. Soustraire les valeurs de mesure de la bande de la valeur de fond pour déterminer leur densité relative. Par exemple, si votre valeur de fond est de 200 et que vous avez quatre bandes avec des valeurs de luminosité de 150, 170, 180 et 190, les valeurs finales pour ces quatre groupes sont 50, 30, 20 et 10.
17 Comparer les groupes expérimentaux utilisant toutes les analyses statistiques que vous souhaitez appliquer. La plupart des expériences utilisent une technique appelée ANOVA (analyse de variance) pour comparer les valeurs entre les groupes. Beaucoup de paquets de statistiques telles que PSAW ont intégré dans les procédures statistiques pour exécuter ANOVAs sur les données correctement formatées.
Conseils et avertissements
- Mélangez votre tampon de blocage immédiatement avant de commencer lavages. Le tampon de blocage peut être facilement contaminée et ne reste frais pendant plusieurs jours.
- Toujours vérifier la fiche de données de sécurité pour déterminer les procédures de sécurité lors de la manipulation des produits chimiques.
- Ne jamais exposer un film non développé à la lumière. Cela endommagerait le film.