PCR ou d'une réaction en chaîne par polymérase, est un procédé utilisé en biologie moléculaire pour amplifier de très faibles quantités d'ADN. Un mélange de réaction PCR nécessite l'ADN matrice, l'ADN polymerase, des amorces et des dNTP (les désoxyribonucléotides triphosphates). Alors que l'ADN polymerase et les dNTP sont disponibles dans le commerce dans des mélanges qui sont largement applicables, les amorces dans la réaction doivent être adaptées à chaque modèle que l'utilisateur souhaite amplifier. Pour la plupart des applications, les amorces doivent être entre 18-24 bases de long.
Instructions
1 Identifier la région de l'ADN que vous souhaitez amplifier.
2 À partir de l'extrémité 5 'de la séquence souhaitée, regardez pour les tronçons de nucléotides qui ne se répètent pas.
3 Écrivez la séquence des bases qui sont complémentaires à l'ADN de modèle dans la région que vous avez identifié. Le début de cette séquence complémentaire est l'extrémité 3 'de l'amorce anti-sens.
4 Allez à l'extrémité 3 'de la séquence désirée et chercher des étendues de nucléotides qui ne se répètent pas.
5 Écrivez la séquence que vous avez identifié à l'étape 4. Assurez-vous de marquer les 'et 3' 5.
6 Commençant à l'extrémité 5 'de la séquence à l'étape 5, écrire la séquence de bases complémentaires à ce volet. Le début de cette séquence complémentaire est l'extrémité 3 'de l'amorce sens.
Conseils et avertissements
- Éviter des amorces qui sont complémentaires les unes aux autres.
- Évitez les amorces qui ont internes complémentarités-il peut conduire à la formation en épingle à cheveux.
- Assurez-vous que les extrémités 3 'des amorces sont exactement complémentaire du brin matrice.
- Amorces qui se terminent en C ou G sont les plus efficaces.
- Amorces devrait être d'environ 50% G + C dans le contenu.
- Tm pour les amorces devrait être similaire à l'autre dans les 3 degrés C.
- Amorces devraient avoir une Tm (température de fusion) entre 55-75 degrés C.