Glutathion ou GSH, est un tripeptide non essentiel fabriqués à partir de la cystéine, le glutamate et la glycine. Il est un antioxydant puissant qui protège les cellules et les organes du corps contre les effets nocifs des ERO, ou des espèces réactives de l'oxygène, qui sont formés à partir de l'oxygène moléculaire à la suite de divers processus métaboliques dans le corps. Des antioxydants, tels que le glutathion, neutralisent l'ERO et les empêcher d'interagir avec et endommageant l'ADN et des protéines dans les cellules. Le rapport de la forme oxydée et réduite de GSH dans votre corps est révélateur de stress oxydatif ROS liés dans votre corps.
Instructions
1 Dessiner approximativement 2 ml de sang par ponction veineuse dans la veine anticubetal avec une aiguille à papillon de calibre 23 fixée à une seringue de 5 ml. Ajouter l'échantillon à tester des tubes contenant de l'héparine de sodium et retourner doucement le tube pour mélanger.
2 Recueillir les globules rouges par centrifugation de l'échantillon à 2500 tours par minute pendant cinq minutes. Congeler et décongeler l'échantillon trois fois pour briser les cellules. Centrifuger la solution de lysat cellulaire pendant 10 minutes à 12 000 tpm et 4 °, et recueillir le surnageant.
3 Retirer la protéine de l'échantillon par addition d'acide sulfosalicylique à 5 pour cent et en centrifugeant l'échantillon à 12 000 tours par minute pendant cinq minutes à 4 degrés. Stocker le surnageant déprotéiné à -112 degrés.
4 Mélanger un agent thiol de détection, GSH-réductase, le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate et un tampon d'essai dans les proportions indiquées par le fabricant du kit pour rendre le mélange réactionnel GSH. La quantité de chaque produit chimique dépend du nombre de tests que vous souhaitez effectuer. On dilue le mélange réactionnel dans de l'acide sulfosalicylique GSH 5 pour cent pour obtenir des concentrations de 16, 32, 63, 125, 250 et 500 microlitres.
5 Ajouter 1 à 10 microlitres de l'échantillon de sang déprotéiné dans les puits d'une microplaque. Ajouter la solution étalon GSH dilué en série, qui est disponible dans le kit de test pour chaque puits pour porter le volume total de chaque puits 10 microlitres.
6 Ajouter 90 microlitres de mélange réactionnel GSH que vous avez fait à l'étape 4 à chaque puits dans la microplaque. Mélanger le réactif en secouant la plaque pendant 30 secondes.
7 Mesurer l'absorbance immédiatement en plaçant la plaque sous une lumière avec des longueurs d'onde de 405 et 415 nanomètres. Incuber la plaque pendant 30 minutes. Prenez les lectures d'absorbance après toutes les cinq minutes pendant l'incubation.
8 Diluer 6 millimolaire de l'échantillon traité avec de l'acide sulfosalicylique de 5 pour cent et une solution de sulfonate trifluromethane. Cela permettra d'éliminer tous les GSH réduit de la solution. Ajouter 1 à 10 micoliters de cette solution dans les puits de microplaques et répétez les étapes 5, 6 et 7. Cela vous aidera à estimer la quantité de GSH oxydé dans l'échantillon.
9 Tracer les concentrations d'absorbance et de l'échantillon sur un graphique pour obtenir la courbe à la fois GSH glutathion réduit et oxydé. Calculer le rapport entre les deux formes de GSH. Des niveaux accrus oxydatif niveaux de GSH indiquent le stress oxydatif et ROS.
Conseils et avertissements
- Suivez toutes les instructions dans le kit du fabricant et le manuel technique avec soin.
- Prenez les précautions nécessaires tels que des gants et des lunettes lors de l'utilisation des échantillons biologiques.
- Assurez-vous que les lectures sont exactes. De petites variations de GSH absorbance lecture peuvent modifier les résultats de votre test.