Dans l'électrophorèse sur gel, les échantillons d'ADN ou de protéines sont séparées - typiquement basée sur la taille - en appliquant un champ électrique qui leur permet de migrer à travers un gel. L'utilisation de l'électrophorèse sur gel est de routine dans les laboratoires de recherche biomédicale et est utilisé pour répondre à une variété de questions, donc il n'y a pas vraiment un moyen universel pour analyser les résultats. Différentes techniques de type Western Blot, Northern Blot et un transfert de Southern, par exemple, impliquent toutes l'électrophorèse sur gel. Si vous faites agarose électrophorèse sur gel d'échantillons d'ADN, le type le plus commun de la procédure, vous aurez généralement besoin de faire au moins deux choses: 1) distinguer les plasmides bruts provenant des inserts, des plasmides entaillés et couper les plasmides et 2) estimer la taille des différents fragments d'ADN. Voici comment cela fonctionne.
Instructions
1 Vérifiez votre cahier de laboratoire pour déterminer quels échantillons ont été chargés dans des voies qui. Lorsque vous avez chargé les puits pour votre gel, vous devriez avoir noté l'identité de chaque voie / échantillon.
2 Déterminer quelle voie contient la «échelle» des normes d'ADN. Ceux-ci sont des fragments d'une longueur connue; leur distance de migration peut être utilisée pour déterminer la taille des fragments de l'échantillon.
3 En utilisant une règle, mesurer la distance sur votre image à partir des puits au colorant de suivi, qui ont voyagé plus loin que l'une des bandes d'ADN (en d'autres termes, il sera au fond du gel). Inscrire ce numéro - les unités que vous utilisez ne sont pas importants.
4 Mesurez la distance sur votre image à partir des puits pour chacune des bandes dans l ' «échelle», puis diviser cette distance par la distance parcourue par la bande de colorant de suivi. Ce calcul vous donne la mobilité relative de chaque bande.
Exemple: Supposons que la bande de colorant de suivi parcouru 6 pouces et nous avons trois groupes qui ont voyagé 5, 4,5 et 3,5 pouces. Quelle est leur mobilité relative?
Réponse: Nous divisons 5, 4,5 et 3,5 par 6 pour obtenir mobilités relatives de 0,833, 0,75 et 0,5833.
5 Entrez les mobilités relatives à votre programme de feuille de calcul (Excel ou tout autre programme similaire que vous utilisez) ainsi que la taille en kilobases de chaque fragment dans l'échelle. (Le fabricant vous donne la taille de chaque fragment dans les échelles qu'ils fournissent, vous devriez donc déjà avoir cette information.)
6 Graphiquement les données avec la mobilité relative sur le x et la taille en kilobases sur l'y.
7 Utilisez la fonction Trendline sur votre programme de feuille de calcul pour tenir une équation aux données. Cette équation doit être une équation de puissance (par exemple x ^ -2) et devrait ajuster les données relativement bien (R-coefficient d'au moins 0,9).
8 Regardez les bandes correspondant à vos échantillons. Rappelez-vous que des fragments d'ADN plus petits se déplacent plus loin à travers le gel de grands fragments d'ADN, de sorte que ceux les plus proches du colorant de suivi sera le plus petit. Notez, cependant, que si l'ADN plasmidique (circulaire) est non coupée, il deviendra "superenroulé" ou tordu comme un cordon téléphonique, ce qui en fait l'amener à voyager plus loin que l'ADN linéaire de la même taille. De même, un plasmide "entaillé" qui a été incomplètement coupé se rendra une distance plus courte que l'ADN linéaire de la même taille. Par conséquent, vous ne pouvez pas estimer la taille des plasmides non coupés de votre gel.
9 Faites correspondre les bandes dans chaque voie avec l'identité de l'échantillon chargé dans cette voie et de déterminer si ce que vous voyez est ce que vous vous attendiez. Cela dépendra de la nature de votre expérience. En général, cependant, si vous digéré un plasmide d'insertion avec deux enzymes de restriction, vous attendez l'insert serait libéré du plasmide; car il est beaucoup plus petit que le plasmide, vous pouvez vous attendre à voir deux bandes dans cette voie, l'un près du sommet et l'autre vers le bas près du fond. Un plasmide coupé avec une seule enzyme de restriction devrait former qu'une seule bande qui se déplace un peu plus loin que le plasmide coupé avec deux enzymes de restriction, mais loin d'être aussi loin que l'insert.
dix Mesurez la distance entre les puits du plasmide coupé et insérer des bandes avec votre règle. Diviser ces chiffres par la distance parcourue par le colorant de suivi de piste pour trouver la mobilité relative des inserts et des plasmides coupés.
11 Branchez la mobilité relative des inserts et des plasmides coupés dans l'équation de votre programme de feuille de calcul calculée pour vous. Ce calcul devrait vous donner une estimation de la taille de ces plasmides.
Conseils et avertissements
- Si vous voyez lumineux, de larges bandes dans le bas de chaque voie unique, vous avez probablement un certain ARN dans votre gel - votre protocole de purification peut être viciée.