La cytométrie en flux est utilisée pour quantifier les propriétés cellulaires, telles que des protéines ou des enzymes. Les cellules sont colorées avec un colorant fluorescent. Puis un laser provoque la tache à fluorescence. Cette lumière fluorescente est projetée sur un courant de fluide et de la diffusion de la lumière est mesurée. De très petites particules peuvent être mesurées de cette façon. Il y a plusieurs questions qui peuvent causer des problèmes. La plupart des problèmes surviennent avec la coloration de l'échantillon et la préparation. Si vous rencontrez de nombreux problèmes avec la machine réelle, puis un technicien devra réparer le cytomètre de flux.
Instructions
Signal faible
1 Augmenter la concentration de la substance que vous testez. S'il n'y a pas de signal ou un signal très faible alors une cause possible est que l'échantillon ne soit pas assez concentré.
2 Vérifiez que les lasers dans la machine sont correctement alignés. Retirer l'échantillon et de flux d'exécution de contrôle des perles à travers la machine. Ajustez les lasers en conséquence si elles sont hors de la ligne.
3 L'anticorps ou de l'échantillon mesuré peuvent avoir été laissé de côté pendant trop longtemps et la fluorescence a disparu. Make up anticorps fraîche et essayer à nouveau.
4 Répétez la procédure à quatre degrés Celsius. La protéine cible d'intérêt peut être intracellulaire et vos réactions ont été effectuées à la mauvaise température. Utilisation de réactifs froids veillera à ce que toutes les réactions haut lorsque cela est nécessaire. Ajout de l'azoture de sodium à la solution peut également aider à maintenir l'intensité de la fluorescence.
haut de fond
5 Vérifiez que les cellules ne sont pas rompu. cellules brisées vont libérer les objets internes et ceux-ci seront repris par le cytomètre créer un arrière-plan de lecture élevé. Évitez d'utiliser les vieilles cellules et les solutions que les vieilles cellules se brisent à mesure qu'ils vieillissent.
6 Faire une nouvelle solution et baissez la vitesse du vortex et centrifuger. Centrifugation à haute tours par minute ou des vitesses élevées de vortex va amener les cellules à briser ouvert.
7 Regardez votre échantillon sous un microscope et assurez-vous de l'échantillon ne soit pas contaminé. Les bactéries présentes dans l'échantillon va créer un niveau de fond élevé.
Tarif Evènement
8 Mélanger délicatement les cellules avant de lancer à travers le cytomètre. Une faible concentration de cellules par millilitre se traduira par un taux d'événements faible. Un échantillon de cytomètre doit contenir un million de cellules par millilitre.
9 Pipeter l'échantillon à plusieurs reprises pour briser les amas de cellules. Clumps va bloquer le tube et peut provoquer un taux d'événements faible. Pipetage avant la coloration des cellules veillera à ce que des touffes ne forment pas.
dix Diluer l'échantillon si vous obtenez un taux d'événement de haut. L'échantillon doit contenir entre 100.000 et un million de cellules par millilitre.
haut fluorescence
11 Diminuer la quantité d'anticorps utilisée. Fluorescence élevée peut être due à la liaison d'anticorps non spécifique. Vous devrez peut-être faire plusieurs réductions différentes pour atteindre l'intensité de fluorescence souhaitée.
12 Assurer vos étapes de lavage sont assez longs et utilisent assez de solution de lavage. Si vous effectuez une coloration intracellulaire puis l'excès d'anticorps peut être emprisonné et n'est pas lavé. Assurez-vous que les étapes de lavage sont corrects. Maquillage des solutions de lavage frais.
13 Insérez une étape de blocage dans votre procédure. Cet agent de blocage est ajouté à l'échantillon avec l'anticorps. La force de l'agent bloquant doit être un à trois pour cent. L'agent de blocage arrête anticorps de se lier à des endroits il ne devrait pas.