Les biologistes et les généticiens utilisent régulièrement la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier des séquences d'ADN spécifiques. La réaction nécessite ADN polymérases - enzymes qui lisent, reproduire, transcrire l'ADN. Ces polymérases sont le plus souvent isolées à partir de bactéries ou archées (un groupe de micro-organismes unicellulaires). L'ADN polymerase Taq, le plus largement utilisé dans la réaction en chaîne par polymérase, tire son nom de la bactérie Thermus aquaticus - Taq pour court - à partir de laquelle elle est isolée.
Pour purifier la Taq polymérase, vous devez avoir accès à certaines pièces d'équipement de laboratoire et les cellules bactériennes E. coli qui ont été transformées avec un vecteur pour la séquence d'ADN Taq polyermase. Après le processus d'isolement, ce qui implique la lyse cellulaire, l'incubation de la chaleur et de centrifugation, un surnageant hébergera votre pur, actif polyermase d'ADN Taq, prêt pour une utilisation dans la PCR.
Instructions
1 30 ml de transfert transformé les cellules E. coli dans un tube de microcentrifugation.
2 Placer le tube dans une machine de centrifugation et centrifuger les cellules à 4300 tpm pendant cinq minutes.
3 Retirer le tube de la centrifugeuse et aliquoter le surnageant avec un Pipetman.
4 Reprendre le culot cellulaire au fond du tube à centrifuger avec 3 ml de tampon I (voir que vous avez besoin pour les formules tampons) contenant 4 mg / ml de lysozyme - une enzyme qui aide briser ouvertes les parois des cellules bactériennes.
5 Faire incuber la suspension de cellules pendant 10 minutes à la température ambiante (environ 18 ° C) pour promouvoir la lyse cellulaire. Cette étape met à profit la résistance de la Taq polymérase à des températures élevées.
6 Ajouter un volume égal de tampon II dans le tube.
7 Incuber la solution pendant 30 minutes dans un bain-marie à 75 °, en étant sûr de mélanger la solution toutes les cinq minutes en inversant le tube.
8 Transférer le lysat résultant dans un tube de microcentrifugeuse et de spin pendant 10 minutes à 12 000 rpm et 20 ° C
9 Transférer la fraction de surnageant dans un tube propre.
dix Mélanger la solution avec un volume égal de tampon de mémorisation.
11 Conserver la solution dans le congélateur à 4 ° C
Conseils et avertissements
- Avant d'utiliser votre Taq polymérase isolée pour la PCR, vous devez déterminer si vous avez isolé une seule espèce de protéine (la polymérase Taq DNA). Pour ce faire, vous aurez envie d'utiliser une électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide à analyser 10 ul du surnageant dilué. L'enzyme polymerase Taq devrait être apparent à 94 kD.
- Récemment, les brevets des Etats-Unis pour la technique PCR et la production de l'ADN polymérase Taq ont expiré, de sorte que les chercheurs sont désormais autorisés à purifier et stocker leurs propres fournitures de Taq polymérase.
- Si vous souhaitez enregistrer une partie de votre Taq polymérase actif pour une utilisation ultérieure, le stocker dans une solution à -20 ° C avec 50% de glycérol. Cette préparation restera actif pendant au moins un an.