empreinte génétique d'une cellule est codée dans son matériel génétique, ou de l'ADN. Que l'ADN ne quitte jamais le noyau de la cellule, pour que ces informations pour entrer dans le cytoplasme où d'autres protéines et des composants biochimiques résident, il est d'abord nécessaire de transcrire l'ADN en ARN messager (ARNm ou du poly (A) ARN). Cet ARNm devient alors traduit en protéines qui effectuent de nombreuses fonctions de la cellule. Pour détecter ou à quantifier les ARNm très rares, faire des sondes pour biopuces ou construire des bibliothèques de molécules d'ADN complémentaires, l'ARNm doit être isolé. Cependant, l'ARN total (ie tous les ARN dans une cellule) extraction et l'isolement de l'ARNm ultérieur ne sont pas des processus mutuellement exclusifs; le premier doit être effectué pour que l'ARNm à extraire.
Instructions
Isolement d'ARNm à partir de l'ARN total
1 TRIzol homogénéisation: l'ARN total comprend tous les ARNm, l'ARN de transfert, l'ARN ribosomal, et d'autres ARN non codantes. Pour les séparer les autres composants cellulaires, la cellule est d'abord éclater ouvert à libérer son contenu. Ceci est réalisé en remettant en suspension les cellules sédimentées par centrifugation (filage à des vitesses élevées) dans le réactif Trizol (Life Technologies). D'autres versions de TRIzol (tels que le réactif TRI de Ambion) fonctionnent de manière similaire.
2 Isolement de l'ARN total: une série de centrifugations est utilisé pour séparer les différents composants (protéines, ADN, ARN) de la cellule dans des couches ou phases, au sein de la suspension. Le haut, la phase de couleur jaune est composé de graisse et peut être jeté. La phase souhaitée est teintée rouge, contient l'ARN total et est retenu. Après avoir effectué une extraction au phénol-chloroforme et une série de lavages à l'alcool en utilisant de l'isopropanol et l'éthanol, l'ARN peut être pastillé pour l'ARNm isolé. Ajouter des inhibiteurs de RNase pour empêcher cette enzyme de dégradation de l'ARN total.
3 ARNm Extraction: Il est courant d'utiliser un kit pour isoler des ARNm, comme les protocoles de laboratoire maison ne génèrent pas de grandes quantités d'ARNm hautement purifiés. Des kits commerciaux comprennent FastTrack 2.0 ou Ambion de Poly Invitrogen (A) Kit d'isolement d'ARNm pur. Ces étapes de base sont communs à ces kits:
a) mélanger le tampon de lyse RNase inhibée fourni dans le kit avec jusqu'à 300 microlitres d'ARN total.
b) la chaleur pendant 5 minutes à 65 degrés Celsius, puis refroidir immédiatement l'échantillon sur la glace pendant une minute.
c) Mélanger cela avec 0,5M de chlorure de sodium, puis dissoudre complètement Oligo dT (acide oligodeoxythymidylic) dans cet échantillon.
d) centrifuger l'échantillon et à récupérer le surnageant, qui est lavé plusieurs fois dans une série de mémoires tampons de liaison et de faibles en sel fournis dans les kits.
e) Eluer ARNm plusieurs fois jusqu'à un volume de kit spécifié (par exemple, 500 microlitres) est obtenu.
f) Précipiter l'éluat d'acétate de sodium et précipitation à l'éthanol. Re-suspendre jusqu'à 20 microlitres de diéthylpyrocarbonate d'eau -Traité (de DEPC).
g) Conserver à -80 degrés Celsius et vérifier la qualité et la quantité par spectrophotométrie.
Conseils et avertissements
- Gardez tous les réactifs, les cellules et l'ARN froid en immergeant dans de la glace. Cela empêche l'ARN d'être dégradée par des enzymes tout autre qui deviennent libérés au cours du processus d'homogénéisation.
- Réactifs tels que TRIzol sont toxiques et ne doivent pas être en contact avec la peau ou les muqueuses. Toujours respecter les protocoles de laboratoire sûrs lors de la manipulation de ce réactif.