Techniques utilisées pour Electrophorèse

July 19

L'électrophorèse sur gel est une méthode pour séparer et identifier des protéines ou des acides nucléiques (ADN et ARN) en fonction de leur taille et de la charge. Chargement des protéines ou des acides nucléiques dans des puits dans une plaque de gel de Polyacrylamide ou d'agarose, puis l'application d'un champ électrique, amène ces molécules de migrer à travers le gel; molécules plus petites ou plus fortement chargées se déplacent plus rapidement.

SDS-PAGE

SDS-PAGE est une technique d'électrophorèse sur gel commun pour la séparation des protéines en masse moléculaire. Elle consiste à prétraiter les protéines avec un détergent appelé dodécylsulfate de sodium (SDS), ce qui les dénature (par exemple, leur fait perdre leur structure). Mercaptoethanol est un autre prétraitement commun; il détruit toutes les liaisons disulfures de maintien sous-unités protéiques ensemble.

Après le prétraitement, les chercheurs à ajouter les protéines à la plaque de gel de polyacrylamide et d'appliquer un champ électrique. Étant donné que le SDS chargé négativement forme un complexe avec les molécules de protéines, elles migrent vers le pôle positif. Les molécules plus grandes migrent plus lentement, de sorte que ce processus sépare les protéines sur la base de la masse.

isoélectrofocalisation

Focalisation isoélectrique repose sur les différences de point isoélectrique, ou le pH auquel une protéine n'a pas de charge nette, pour séparer les protéines. Le traitement d'un tube étroit d'un gel de polyacrylamide avec des tampons spéciaux crée un gradient de pH, de sorte qu'une extrémité du tube est à un pH élevé, et l'autre est à un pH faible.

Lorsqu'ils sont soumis à un champ électrique, chaque protéine dans l'échantillon migre à travers le gel jusqu'à ce qu'il atteigne un pH auquel il n'a pas de charge nette; à ce stade, le champ électrique ne peut pas conduire plus loin. Etant donné que les protéines ont des points isoélectriques différents, isoélectrofocalisation est un moyen efficace pour séparer les protéines.

2-D PAGE

électrophorèse PAGE 2-D est une combinaison de SDS-PAGE et la focalisation isoélectrique. La première étape consiste à séparer les protéines par isoélectrofocalisation; la seconde consiste à placer le gel à partir de la phase isoélectrofocalisation au sommet de l'autre plaque de gel, en traitant les protéines avec du SDS, et l'application d'un champ électrique.

Ainsi, 2-D PAGE sépare les protéines à la fois par le point isoélectrique et masse moléculaire pour former un 2-D "carte" des protéines dans l'échantillon.

Agarose Gel Electrophoresis

Les scientifiques se séparent généralement des fragments d'ADN en utilisant un gel d'agarose plutôt que d'un gel de polyacrylamide. Agarose est une poudre amylacée extraite à partir d'algues. Le mélange avec un tampon et le chauffage dans un four micro-ondes crée un gel épais qui se solidifie en refroidissant; un peigne d'échantillonnage crée alors «puits» dans le gel, qui maintiennent les échantillons de protéines.

une électrophorèse sur gel d'agarose est courant dans l'empreinte génétique, ainsi que dans les tests de polymorphisme (RFLP) de restriction des fragments de longueur; celle-ci est une technique plus ancienne qui consiste à couper l'ADN en fragments en utilisant des enzymes de restriction (enzymes qui forment des coupes à des séquences particulières), et en les séparant sur la base de la taille.

séquençage de l'ADN

La plupart des méthodes de séquençage de l'ADN comprennent l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Dans ce processus, les chercheurs incubent des copies multiples d'une matrice d'ADN simple brin avec les nucléotides (les blocs de construction pour la synthèse de l'ADN) et de l'ADN polymérase (une enzyme qui réplique l'ADN).

Lorsque certains nucléotides chimiquement modifiés se lient à l'extrémité d'une chaîne en croissance de nucléotides d'ADN, elles se terminent cette chaîne; ces nucléotides de terminaison de chaîne spéciaux sont appelés didésoxynucléotides. Il existe quatre types de didésoxynucléotides, dont chacune porte une couleur différente du colorant fluorescent.

Comme les ADN polymérases faire des copies de la matrice d'ADN simple brin, ils insèrent parfois un didésoxynucléotide en place d'un nucléotide ordinaire. Etant donné que cela se produit dans des endroits différents pour les différentes copies de la matrice, le mélange résultant contient des copies partielles de l'original qui se terminent par des endroits différents, et ont donc des longueurs différentes.

Ensuite, une électrophorèse sur gel de polyacrylamide sépare les fragments sur la base de la taille, et d'un détecteur spécifique identifie le colorant fluorescent sur le didésoxynucléotide à l'extrémité de chaque chaîne. L'ordre dans lequel ces colorants apparaissent révèle l'ordre des nucléotides dans la matrice d'ADN d'origine, et donc la séquence d'ADN d'origine.