Comment Calibrer Colonnes Gel Filtration

February 15

des colonnes de filtration sur gel sont utilisées pour séparer les protéines à partir de mélanges complexes. Etant donné que chaque protéine a un poids moléculaire unique, ils peuvent être amenés à se séparer en couches distinctes, en les migrant à travers une colonne de filtration contenant une matrice de gel uniformément répartie. Pour identifier correctement chaque protéine qui est séparé, vous devrez calibrer les colonnes à l'aide de plusieurs protéines de poids moléculaire connu.

Instructions

1 Retirer les flacons de l'anhydrase carbonique, le cytochrome C et aprotinine du réfrigérateur ou du congélateur et leur permettre d'atteindre la température ambiante. Ajouter 4 mg de chaque protéine à un tube de centrifugation par ml de gel dans la colonne de filtration. Ajouter 961 mcl de sel de base par milligramme de protéine dans chaque tube centrifugeur pour dissoudre les protéines. Ajouter 39,2 mcl de ferritine par millilitre de gel à chaque tube et puis mélanger dans une centrifugeuse.

2 Éteignez la pompe à colonne de filtration et de fermer le robinet d'arrêt à l'entrée de la colonne. Dévissez, mais ne retirez pas, le haut de la colonne de filtration. Réglez la pompe au débit maximal pour la colonne et redémarrer la pompe jusqu'à ce que le matériau tampon a été prélevé. Arrêter la pompe.

3 Ajouter 1 ml de chaque protéine sur la colonne de filtration à l'aide d'une pompe à pipeter. S'égoutter les protéines vers le bas à l'intérieur de la colonne d'une hauteur de 1 cm à 2 cm, de travail autour du bord intérieur de la colonne. Laisser le mélange de protéines à régler au-dessus de la matrice de gel.

4 Placez le tuyau de sortie de la pompe dans un endroit propre, sec 250 ml cylindre gradué. Redémarrez la pompe à un débit de 0,30 ml par minute et exécuter les protéines dans la matrice de gel. Lorsque la pompe est en marche, rincer les parois du tube à l'aide de la pompe de pipette et une petite quantité de liquide tampon. Une fois que les protéines sont complètement entrés dans la matrice de gel, de réduire la vitesse de pompe à 0,02 ml par minute et la pompe dans une couche de 5 cm à 7 cm de liquide tampon au-dessus de la matrice.

5 Déconnecter le capuchon de la colonne du robinet. Nettoyer le bouchon de la colonne et à l'intérieur de la colonne en utilisant des lingettes de nettoyage scientifiques. Remettre le bouchon de colonne. Remplir le réservoir tampon de liquide tampon. Fixer un corps de seringue sur le robinet et l'ouvrir. Utiliser la seringue pour aspirer une petite quantité de tampon à travers le tube et dans la seringue. Fermez le robinet et le remettre en place au sommet de la colonne. Ouvrez le robinet et vérifier les fuites.

6 Exécutez la colonne à 0,02 ml par minute pendant plusieurs jours, jusqu'à ce que la bande de ferritine se rapproche de la fin de la colonne. Collecter tout le gel de filtration qui est pompé dans le cylindre gradué.