Chromatographie liquide haute performance (HPLC) est l'une des techniques les plus utilisées pour l'analyse chimique en laboratoire analytique moderne. Le développement d'une méthode HPLC est la partie la plus critique de toute analyse HPLC. La méthode de HPLC est une définition des paramètres critiques et les processus requis pour l'analyse d'un composé chimique particulier. Sans une bonne méthode, les résultats présentés sont sans valeur. Une sélection appropriée de solvant, la colonne et le détecteur sont essentiels pour obtenir une analyse significative. La partie la plus importante du processus de développement est la planification. Collecte ensemble des informations de base sur l'analyte (composé chimique d'intérêt) aide dans le processus de développement de la méthode. Même si la collecte des informations de base va prendre du temps, le gain sera dans un temps de développement plus rapide pour la dernière méthode. Sans une bonne information, vous faites des choix pauvres concernant le processus de développement de la méthode.
Instructions
1 Rechercher la littérature disponible pour voir s'il existe déjà une méthode pour le même analyte ou très similaire. Vous devriez examiner les revues de produits chimiques et des livres de référence des résultats HPLC pour les méthodes pour le produit chimique d'intérêt. Le processus d'élaboration d'une nouvelle méthode prend du temps. Il est beaucoup plus efficace d'utiliser la méthode développée précédemment.
2 Effectuer une étude de solubilité sur l'analyte ou d'un groupe d'analytes. Les caractéristiques de solubilité sont essentiels dans le choix d'un matériau de colonne, le mode solvant et particulier de HPLC à entreprendre.
3 Sélectionnez la meilleure phase ou colonne matériau fixe pour correspondre au mieux à vos analytes. La phase stationnaire est contenue dans la colonne utilisée dans l'analyse par HPLC. Il est le composant principal qui sépare les composés chimiques de l'autre. Le matériau de garnissage de colonne est un matériau à base de silice qui possède des groupes fonctionnels de liaison qui interagissent avec les composés chimiques lors de leur passage à travers la colonne. Chaque produit chimique interagit différemment et est attirée par le groupe fonctionnel à des degrés divers. Au moment où l'échantillon inconnu parcourt la longueur de la colonne, les produits chimiques qui ont très peu d'intérêt pour le matériau de la colonne sortiront en premier, suivie par chacune des autres substances chimiques qui composent l'échantillon afin de degrés de degré de interaction.The attraction pour la phase stationnaire (matériau d'emballage) va peser lourdement sur le matériau particulier choisi.
4 Choisir un solvant pour l'analyse. Le solvant doit fournir une certaine solubilité à l'analyte et bien travailler avec la phase stationnaire. Le solvant est un liquide organique polaire ou qui traverse l'ensemble du système et transporte l'échantillon lors de son écoulement. Le solvant transporte l'échantillon à travers le système et les aides dans le processus de séparation. L'analyte interagit avec le matériau de la colonne lors de son passage à travers la colonne. Le degré d'interaction avec le matériau de la colonne provoque une séparation des produits chimiques les uns des autres. Comme solvant transporte l'échantillon à travers la colonne de séparation, continue de se produire entre les composés chimiques dans l'échantillon et par l'extrémité de la colonne d'une bande individuelle dans le courant de solvant représentera chaque composé chimique. Ce procédé permet la séparation des analytes de l'autre.
5 Décider de la longueur de la colonne efficace pour obtenir le degré de séparation souhaité. Plus la colonne est élevée, plus la séparation. longueurs de colonnes typiques sont de 50 cm, 100 cm, 150 cm et 250 cm.
6 Considérons dont le diamètre interne de la colonne est le plus approprié pour votre application. Le diamètre interne de la colonne définit la taille maximale de l'échantillon qui peut être traitée par la colonne sans surcharger la colonne. Plus le diamètre interne, le moins de solvant est nécessaire pour exécuter l'analyse et l'échantillon moins est nécessaire. Cela peut présenter un grand économies de coûts pour une entreprise qui a l'intention d'exécuter la méthode souvent.
7 Sélectionnez le meilleur détecteur pour votre analyte. Il existe une multitude de détecteurs disponibles chacun avec ses propres caractéristiques. Le détecteur répond à des composés chimiques présents dans le courant de solvant lors de son passage dans la colonne sur son chemin vers le conteneur de déchets. Des exemples des types de détecteurs qui sont communs comprennent des détecteurs de fluorescence, Ultraviolet / spectrophotomètres visibles et spectromètres d'indice de réfraction. Selon les informations que vous désirez de l'analyse, vous devez sélectionner le détecteur qui va lui fournir.
8 Assemblez l'instrument avec les caractéristiques choisies et commencer une étude sur le meilleur débit et taille de l'échantillon pour atteindre les résultats que vous désirez. Le débit sélectionné est le débit qui donne les résultats les plus rapides avec la meilleure séparation de composés chimiques. Comme le débit augmente le fait de la pression du système, de sorte que vous devez faire des compromis pour obtenir la meilleure méthode. Parfois, vous devez exécuter à un débit plus faible pour rester dans les limites de la pompe à solvant et d'accepter le plus de temps d'analyse.
Conseils et avertissements
- Utilisez uniquement des solvants Spectro ou HPLC. Des traces d'impuretés peuvent se concentrer sur la colonne.
- Choisir seulement un solvant qui ne va pas endommager le matériau de l'instrument ou de la colonne.
- Enquêter une seule variable à la fois. Une fois que vous avez terminé cette étude tient cette variable et de commencer une étude changeant la variable suivante.