Depuis sa découverte par Kary Mullis en 1983, PCR (réaction en chaîne par polymérase) est devenue une procédure standard réalisée dans les laboratoires du monde entier. PCR peut amplifier un seul brin d'ADN en milliards de brins en seulement quelques heures. La réaction nécessite l'ADN matrice, désoxyribonucléotides (dNTP), l'ADN polymérase, et deux amorces --- un à dupliquer l'ADN dans le «sens» direction et l'autre pour dupliquer l'ADN dans le sens anti-sens. Pour de meilleurs résultats, ces lignes directrices devraient être utilisées en conjonction avec le logiciel de conception d'amorce.
PCR
ADN existe sous la forme de deux chaînes en hélice constitué d'un squelette de sucre et de phosphate et de désoxyribonucléotides: adénine (A), de la thiamine (T), la cytosine (C) et guanine (G). Les deux brins d'ADN sont complémentaires les unes aux autres. Autrement dit, l'un sur un brin se mariera avec un T sur l'autre brin; C et G paire jusqu'à la même manière. La direction 5 'à 3' des brins est complémentaire. En raison de ce complément, la replication de l'ADN se produit d'une manière semi-conservatif.
Dans la PCR, cela implique d'augmenter la température de telle sorte que l'ADN double brin se désagrège ou se dénature, en simples brins. Avec le nombre relativement important brin complémentaire, encombrant de la route, une séquence complémentaire courte peut recuire. Cette courte séquence est une amorce.
Une fois recuite, l'ADN polymérase peut commencer à ajouter des monomères de nucléotides (dNTP) à l'extrémité 3 'de l'amorce. Ceci est la phase «d'extension». Après l'extension, l'ADN est dénaturé et le cycle recommence.
ADN cible
La première étape dans la conception des amorces est d'identifier une séquence appropriée dans le gène d'intérêt (GOI) pour l'amplification. Ceci est désigné sous le nom de «cible». Il est important que la séquence d'ADN de la cible est unique par rapport au reste du code génétique de l'organisme. Dans l'idéal, la séquence cible sera de 100 à 500 paires de bases, en fonction du type d'analyse le chercheur souhaite effectuer. Les amorces elles-mêmes ne doivent être 18 à 25 paires de bases. Le fragment d'ADN généré par les amorces dans une PCR est appelée un amplicon. La taille de l'amplicon peut être déterminée en soustrayant la différence dans les paires de bases entre la position de départ de l'amorce sens et la position d'extrémité de l'amorce anti-sens.
Trouver des séquences d'amorces
A partir de l'extrémité 5 'de la séquence cible, trouver un fragment d'ADN d'environ 18 à 24 paires de bases de long. Pour une meilleure efficacité de la réaction, la séquence choisie doit être exempt de nucléotides qui se répètent ou se déplacent sur. Une fois cette séquence est identifiée, écrivez-le dans le sens 5 'à 3'. Ensuite, écrire les lettres pour les bases qui sont complémentaires de la séquence choisie. La nouvelle séquence dérivée est l'amorce anti-sens.
A l'extrémité 3 'de la séquence, identifier un autre tronçon de 18 à 24 nucléotides qui répondent aux mêmes critères. Notez cette séquence en gardant à l'esprit la direction est maintenant 3 'à 5'. Encore une fois, écrire les lettres pour les bases complémentaires. Cette séquence est l'amorce sens.
Pour les deux sens et des amorces antisens, y compris 3 S et / ou Cs au cours des cinq dernières paires de bases de l'extrémité 3 '. Assurez-vous également que les amorces ne sont pas complémentaires les unes aux autres. Enfin, assurez-vous de vérifier le potentiel de formation 'haripin', qui résulte d'une amorce de pliage et appariement de bases à lui-même.