Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) a de nombreuses applications dans des analyses de laboratoire. Comme prélude à l'exécution d'une analyse proprement dite, il est important d'étalonner un système HPLC, y compris la colonne de chromatographie, ce qui produit la séparation des analytes chimiques. L'étalonnage assure que les divers analytes peuvent être identifiés par leur temps de séjour dans la colonne, ainsi que quantifié en fonction de l'amplitude de la réponse du détecteur.
Instructions
HPLC Calibration de colonne
1 Décider de la méthode HPLC paramètres en vertu desquels vous étalonner la colonne. Celles-ci comprennent des facteurs tels que la phase mobile particulier solvant utilisé, le taux de solvant de débit, le type de système de détection et les réglages du détecteur, ainsi que le produit chimique que vous allez tester pour (l'analyte). Souvent, une méthode existante peut être utilisée, telle que celle spécifiée par un organisme de réglementation (l'Agence de protection de l'environnement, par exemple).
2 Préparer une série de solutions d'étalonnage standard. Ceux-ci seront préparées en dissolvant des quantités croissantes du produit chimique de l'analyte dans un solvant approprié. Le solvant sera spécifiée par la méthode, ou souvent le même solvant utilisé pour la phase mobile peut fonctionner pour dissoudre l'analyte. Un ensemble d'étalonnage typique serait composé de cinq ou six solutions, couvrant une gamme de concentrations allant de zéro à 100 parties par million.
3 Mettez le CLHP et ses composants associés, tels que la pompe de la phase mobile, le détecteur et l'ordinateur d'acquisition de données.
4 Relier l'entrée de colonne à la ligne de sortie de la pompe à solvant et connecter la sortie de colonne à la ligne d'entrée du détecteur.
5 Démarrer la pompe pour commencer l'écoulement de la phase mobile à travers la colonne à la vitesse spécifiée par la méthode. En l'absence d'une méthode standard, un débit de 1 à 2 millilitres par minute, est typique.
6 Injecter chaque solution d'analyte étalon dans la HPLC, une à la fois, de la plus basse à la plus haute concentration. La méthode précisera le volume à injecter, ou un volume typique de 20 à 50 microlitres peut être utilisé.
7 Pour chaque injection, observer la trace de sortie du détecteur sur l'ordinateur d'acquisition de données. Lorsque la sortie du détecteur montre un pic évident en réponse à l'analyte sortant de la colonne et passant par le détecteur, arrêter l'acquisition de données, enregistrez le fichier de données par voie électronique, et injecter l'échantillon suivant.
8 Après que tous les échantillons soient injectés et un fichier de données de réponse du détecteur sont enregistrées pour chacun, en utilisant le logiciel d'acquisition de données pour intégrer les pics pour chaque fichier pour déterminer le temps de rétention de l'analyte et la zone de pic pour chaque injection.
9 Comparer les temps de rétention pour toutes les injections afin d'assurer qu'ils sont tous assez proches les uns des autres (à moins de approximativement plus ou moins 5 pour cent). Enregistrer ce que le temps de rétention pour cet analyte sur cette colonne à l'aide de l'analyse ultérieure des échantillons inconnus.
dix En utilisant le logiciel d'acquisition de données, ou un programme tel que Excel, l'entrée d'une série de points de données comprenant des concentrations d'analyte solution standard et les surfaces des pics correspondants. Avoir le logiciel génère une équation linéaire reliant les deux sous la forme de: Peak = (m) (concentration) + b, où m est la pente et b l'intersection. C'est l'équation d'étalonnage pour cet analyte sur cette colonne.
Conseils et avertissements
- A noter que l'étalonnage effectué ici est également dépendant de l'instrumentation associée HPLC, tel que le détecteur et la pompe. Si la colonne est déplacé vers un autre HPLC, ou si des conditions telles que le débit de solvant sont modifiés, l'étalonnage doit être répétée.
- Les temps de rétention peuvent changer avec le temps en raison de divers facteurs tels que l'usure de la colonne. La HPLC doit être recalibré souvent même si aucune modification ne soit apportée à l'instrument ou de la méthode.