Une des méthodes les plus courantes de calculer une concentration de protéine dans un environnement de laboratoire consiste à utiliser un dosage de Bradford. Le Bradford réactif est un réactif colorimétrique qui change de couleur en fonction de la concentration en protéines. En combinant une courbe standard connu avec le Bradford réactif, vous pouvez créer une mesure contre laquelle vous pouvez calculer la concentration de toute protéine, y compris des anticorps.
Instructions
Créer une norme
1 Mesurer 200 mg de BSA sur le papier de pesage en utilisant une échelle de laboratoire. Entourez dans un tube à centrifuger. Ajouter 2 ml de tampon dans le tube de microcentrifugation contenant 200 mg de BSA. Nommez ce tube "1."
2 Vortex Tube 1 jusqu'à ce que la BSA est complètement dissous.
3 Supprimer 500 ul de BSA dans un tampon et de le transférer dans un second tube. Nommez ce tube "2." Ajouter 500 ul de tampon plaine Tube 2.
4 Retirer 200 ul de BSA dans un tampon de tube 1 et le transférer dans un nouveau tube. Nommez ce tube "3." Ajouter 800 ul de tampon plaine Tube 3.
5 Retirer 100 ul de BSA dans un tampon de tube 1 et le transférer dans un nouveau tube. Nommez ce tube "4." Ajouter 900 ul de tampon plaine Tube 4.
6 Retirer 10 ul de BSA dans un tampon de tube 1 et le transférer dans un nouveau tube. Nommez ce tube "5." Ajouter 990 ul de tampon plaine Tube 5. Tubes 1- 5 comprennent une série standard graduée. Le premier tube a une concentration connue de 100 mg / ml; la seconde, à 50 mg / ml; le troisième, 20 mg / ml, le quatrième, 10 mg / ml; et le cinquième, 1 mg / ml. Chaque tube contient environ 1 ml de solution.
Créer Anticorps Dilutions
7 Ajouter 5 0UL d'anticorps purifiés à 95 0UL de tampon. Nommez ce tube "A."
8 Ajouter 10 ul d'anticorps purifié à 990 ul de tampon. Nommez ce tube "B."
9 Ajouter 2 ul d'anticorps purifiés à 998 ul de tampon. Nommez ce tube "C."
Chargez la plaque
dix Placer 0,5 ml de tampon brut dans les premiers puits dans deux colonnes de la plaque multipuits.
11 Placer 0,5 ml du contenu du tube 1 dans le deuxième puits des deux premières colonnes de la plaque multipuits. Continuer sur la série graduée jusqu'à ce que les deux premières colonnes contiennent 0,5 ml d'une solution étalon de BSA de chacun des tubes 1 à 5, y compris les puits de tampon ordinaire.
12 Ajouter 0,5 ml de réactif Bradford à chaque puits. Agiter la plaque pour mélanger le réactif avec les solutions protéiniques, en faisant attention à ne pas renverser le contenu de l'un des puits. Attends 5 minutes.
13 Lire la plaque selon le protocole spécifique à votre lecteur de plaques à une longueur d'onde de 595 nm.
Calculer Anticorps Concentration
14 Copiez les valeurs lues à partir du lecteur de plaque dans Microsoft Excel.
15 Créer un graphique à partir des deux colonnes de valeurs représentant la norme BSA en utilisant l'Assistant graphique dans Microsoft Excel.
16 Tracer les points mesurés à partir des dilutions d'anticorps dans le graphique Excel. Lire la concentration correspondante de la protéine en fonction de la valeur de l'axe des Y pour le point sur le graphique d'Excel de dilution d'anticorps.
17 Selon que vous utilisez les valeurs obtenues à partir de Tube A, B ou C, il faut multiplier la valeur soit 20, 40 ou 500, respectivement. La valeur résultante est la concentration de votre anticorps purifié.
Conseils et avertissements
- Utilisez des tampons de suspension sans protéines ou vos résultats seront inexacts parce que le Bradford réactif réagit avec la protéine non spécifique.